ICS67.120.30B50DB21辽宁省地方标准 DB21/T 2627—2016 鱼淋巴囊肿病毒实时定量PCR检测方法 The real-time PCR detection method for Lymphocystis disease virus of fish 2016-05-09发布2016-07-09实施辽宁省质量技术监督局发 布DB21/T 2627—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局；山东出入境检验检疫局；大连民族大学。本标准主要起草人：李叶，岳志琴，杜雄伟，庞艳华，张雪，刘钊本标准系首次发布。IDB21/T 2627—2016鱼淋巴囊肿病毒实时定量PCR检测方法1范围本标准规定了鱼类淋巴囊肿病毒荧光PCR检测的操作方法。本标准适用于鱼类淋巴囊肿病毒的检测、监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088 出入境动物检疫采样SN/T 2123 出入境动物检疫实验室样品采集、运输、和保存规范3缩略语下列缩略语适用于本标准：荧光PCRCt值荧光聚合酶链反应。每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。脱氧核糖核酸。DNATaq酶Taq DNA聚合酶。4仪器、耗材和试剂4.1仪器与耗材4.1.1荧光PCR检测仪4.1.2高速台式冷冻离心机4.1.3高压灭菌器4.1.4涡旋振荡器器4.1.5冰箱：4 ℃±1 ℃，-20 ℃±2 ℃4.1.6生物安全柜4.1.7微量可调移液器及配套带滤芯吸头4.1.81.5 mL 和50 mL离心管4.1.9剪刀、镊子、研钵4.1.10石英砂4.2试剂4.2.1含50ug/mL链霉素的M199细胞培养液。1DB21/T 2627—20164.2.24% NaOH。4.2.30.9%灭菌生理盐水。4.2.420 mg/mL蛋白酶K。4.2.510﹪ SDS。4.2.6pH5.2 3M醋酸钠。4.2.7pH 8.0 TE 缓冲液。4.2.8检测引物和探针，预计扩增产物82bp。正义引物 P1：5’- CAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTT-3’反义引物 P2：5’ - CAGCAGCAATACCCGGTAAATC -3’探针：5’FAM-TTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCT-TAMRA -3’注：除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水为GB/T 6682规定的一级水。5操作步骤5.1样品采集采集患病鱼的皮肤、鳍、眼等囊肿、病变组织或采集无临床症状鱼的脑、脾、肾组织，4 ℃保存应不超过 24h，若需长期保存应置-20℃以下，但应避免反复冻融，或放于加入冰块的保温箱中，密封后直接送实验室检测。按GB/T 18088和SN/T 2123执行。5.2样品处理将样品放于研钵中，加入 1/10体积石英砂，研磨后，按1：10加入含抗生素 50ug/mL的M199液后倒入 50mL离心管中，4 ℃过夜或18℃2h，直接进行核酸抽提或 4-20℃保存备用。5.3提取DNA在处理完的样品中加入 1.5 mL 4％的 NaOH 溶液，同时设立阴性对照和阳性对照，37 ℃恒温处理30min或常温下1h，使其充分液化；若液化不完全，可适当再加入少量4％的NaOH；将液化后的样本500 μL分别加入1.5mL无菌离心管中，13 000 r/min离心10min；弃上清，用微量移液器尽量吸干液滴，沉淀中加入1 mL灭菌生理盐水，振荡悬浮，13000 r/min离心10min，弃上清，加入1mL灭菌生理盐水，13 000 r/min离心10 min，弃上清，用0.5 mL灭菌生理盐水重新悬浮沉淀，加12.5μL20mg/mL的蛋白酶K和50 μL的10﹪的SDS，55 ℃水浴作用30min；分别用Tris饱和酚、等体积酚：氯仿和氯仿各抽提一次；吸取上层水相，加1/