ICS 11.220B 41团体标准T/CVMA 10—2018猪圆环病毒Ⅱ型微滴式数字 PCR检测方法Method of Droplet Digital PCR for Detection of Porcine Circovirus Type 2CVMA中国兽医协会2018 - 10 - 24发布2018 - 10 - 24实施中 国 兽 医 协 会发布T/CVMA10—2018前言本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草本标准由中国兽医协会提出并归口本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心山东省动物疫病预防与控制中心本标准主要起草人：原霖辛盛鹏宋晓晖王传彬杨林陈静胡冬梅董浩张月李晓霞汪葆玥亢文华孙圣福王晓英徐琦孙雨陈亚娜CVMA中国兽医协会IT/CVMA10—2018猪圆环病毒Ⅱ型微滴式数字 PCR检测方法1范围本标准规定了猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus type 2PCV-2)微滴式数字PCR检测方法的试剂与耗材仪器与设备操作步骤结果分析本标准适用于猪圆环病毒Ⅱ型核酸的检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件NY/T 541兽医诊断样品采集保存与运输技术规范3原理微滴式数字PCR（Droplet Digital PCRddPCR）的技术原理是利用微滴化技术将一份反应体系分成数万个纳升级的微滴进行定量PCR检测本质上是将传统定量PCR的一次检测变成数万次检测提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度微滴发生器可以将每一份扩增体系分成数万个均匀的纳升级微滴每个微滴不含或者含有一个至数个待检核酸靶分子每个微滴都将作为一个独立的 PCR扩增体系在PCR扩增仪上进行终点PCR扩增利用微滴分析仪对每个微滴进行检测有荧光信号的微滴判读为1没有荧CVMA光信号的微滴判读为0然后根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例计算出待检靶分子的浓度或拷贝数中国兽医协会4试剂与耗材4.1提取宜选取商品化的病毒DNA提取试剂盒4.24.3微滴式数字 PCR扩增试剂宜按照不同的微滴式数字PCR平台的说明书选取推荐的微滴式数字PCR扩增试剂引物和探针PCV-2上游引物(PCV-2F)：5＇- CCAGGAGDGCGTTGTGACT -3＇PCV-2下游引物(PCV-2R)：5＇- CGCTACCGTTGGABAAGGAA -3＇1T/CVMA10—2018PCV-2探针(PCV-2 P)：5＇-FAM- AATGGCATCHTCAACACMCGCCTCT -BHQ1-3＇5仪器与设备生物安全柜PCR扩增仪数字PCR微滴发生器数字PCR微滴分析仪纯水仪核酸定量仪涡旋震荡仪6操作步骤6.1样品采集及运输按照NY/T 541执行6.26.3DNA提取按照所选取的病毒DNA提取试剂盒说明书进行提取微滴式数字 PCR扩增方法每个样品微滴式数字PCR扩增体系设置3个平行微滴式数字PCR扩增体系配制如表1该步骤按照不同微滴式数字PCR平台的说明书进行操作表 1微滴式数字 PCR扩增体系试剂终浓度体积10μL1μL2×酶混合液a/CVMAPCV-2 F（10 μmol/L）0.5μmol/L中国兽医协会PCV-2 R（10 μmol/L）PCV-2 P（10 μmol/L）DNA模板0.5μmol/L1μL0.2μL2 μL0.1μmol/L///无核酸酶水5.8 μL20 μL总体系注：使用微滴式数字 PCR平台进行实验时应依据不同微滴式数字PCR平台说明调整扩增体系的组分和最终体积并保证表中所列组分的终浓度不变a微滴式数字PCR扩增试剂反应液配制后使用微滴发生器对扩增体系进行微滴生成微滴生成后进行微滴式数字PCR扩增荧光分析步骤采用FAM单荧光通道微滴式数字PCR扩增程序如表2所示2T/CVMA10—2018表 2微滴式数字 PCR扩增程序步骤温度持续时间10 min30 s循环数1234595 ℃95 ℃55 ℃98 ℃4 ℃1401 min10 min60