ICS65.150 B50 D B 32 备案号： 江 苏省地方标准 DB32/T1730—2011 养殖水体细菌总数测定—荧光显微计数法 Fluorescencemicroscopycountingmethodwasusedtomeasurethecount ofaquaculturewaterbacteria 2011-04-15发布 2011-06-15实施 发布 江苏省质量技术监督局  DB32/T1730—2011 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准的附录A为欧亿·体育（中国）有限公司性附录。 本标准由江苏省海洋与渔业局提出。 本标准起草单位：江苏省淡水水产研究所。 本标准主要起草人：杨鸢劼、陈大鹏。  DB32/T1730—2011 养殖水体细菌总数测定--荧光显微计数法 1范围 本标准规定了荧光显微计数法测定养殖水体细菌总数的试剂、仪器设备、操作步骤、计数方法 和计算。 本标准适用于养殖水体细菌总数的测定，也适用于环境水域。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于 本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.28食品卫生微生物学检验、染色法、培养基和试剂 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 3原理 细菌组织细胞经阳离子荧光探针--吖啶橙（AcridineOrange，AO）荧光色素染色后，以嵌入或 静电吸引与蛋白DNA/RNA相结合。在生物荧光显微镜高压汞灯发射光谱激发光下（200~ 600nm），活 菌细胞和受损细胞（死细胞）分别产生黄绿色到绿色荧光和橙色到红色荧光。镜检计数待检样品中 活菌细胞和死菌细胞数，同时也可以计数总菌数。 4试剂 所用试剂除特别说明外，药品均为分析纯(AR)。无菌水均为经0.2μm滤膜过滤的双蒸去离子 水，符合Ⅰ级水的规格。 4.1甲醛溶液(40%) 4.2萘啶酮酸溶液（0.002%） 萘啶酮酸（C12H12N2O3） 无菌水 0.002g 100mL 待萘啶酮酸充分溶解后，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置灭菌试剂瓶室温保存。 4.3酵母膏溶液（0.025%） 酵母膏（生化试剂） 无菌水 0.025g 100mL 将酵母膏在无菌水中加热，充分溶解后，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置灭菌试剂瓶室温保存。 4.4氢氧化钠溶液（4%） 氢氧化钠（NaOH） 无菌水 4g 100mL 1  DB32/T1730—2011 4.5磷酸盐缓冲液（pH7.2±0.05） 磷酸二氢钾（KH2PO4·2H2O） 无菌水 34g 500mL 待磷酸二氢钾充分溶解后，用NaOH溶液调整pH7.2±0.05，4℃保存。 4.6吖啶橙染色溶液（0.1%） 吖啶橙（C17H19N3·HCl·0.5ZnCll2） 磷酸盐缓冲液（pH7.2±0.05） 10mg 100mL 将吖啶橙和磷酸盐缓冲液混合，充分溶解后，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置灭菌棕色试剂瓶， 室温保存，有效期6个月。操作时需戴手套。 4.7苏丹黑B溶液 苏丹黑B（C29H24N6） 无水乙醇（C2H6O） 无菌水 100mg 75mL 75mL 将苏丹黑B在乙醇中充分溶解后，再与无菌水混合，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置棕色试剂瓶暗 处保存，有效期6个月。 4.80.5mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0～9.5) 碳酸氢钠（NaHCO3） 碳酸钠（Na2CO3） 无菌水 3.7g 0.6g 600mL 将碳酸氢钠和碳酸钠在无菌水中充分溶解后置试剂瓶，密封保存。 4.9缓冲甘油封片剂 碳酸盐缓冲液(pH9.0-9.5) 无荧光甘油（C3H8O3） 10mL 90mL 按比例将碳酸盐缓冲液和无荧光甘油在搅拌器上充分混匀后4℃保存，待气泡排除后方可使 用。 4.10无荧光显微镜物镜镜油TypeFF（Nd=1.516） 5仪器及设备 5.1荧光显微镜，具落射汞灯装置、摄像转换器及监视器,滤光片组：450～490nm激发，520nm 屏障，目镜（10×），油镜物镜（100×）。 5.2电子天平：感量0.0001g。 5.3电位pH计。 5.4超净工作台。 5.5高压灭菌锅。 5.6采样瓶，50mL螺盖聚丙烯塑料瓶。 5.7醋酸纤维滤膜：?25mm，孔径0.22μm。 5.8过滤器（包含抽滤管）。 5.9量筒（容量20mL）。 5.10镊子（平头）。 5.11酒精灯。 5.12载玻片：25.4mm×76.2mm(长×宽)，厚0.80mm。 5.13盖玻片：18.0mm×18.0mm(长×宽)，厚0.17mm。 2  DB32/T1730—2011 6测定步骤 6.1准备 6.1.1采样瓶使用前用5%HCl溶液浸泡1h以上，0.2μm滤膜过滤的双蒸去离子水漱洗。 6.1.2采样瓶密闭包装后置高压灭菌锅，1.05kg/cm（121.3℃），保持20min，冷却后，无菌室 2 保存备用。 6.1.3醋酸纤维滤膜用苏丹黑B溶液浸泡24h，消除滤膜自发荧光。 6.1.4处理过的醋酸纤维滤膜平整放置于滤器底座。 6.1.5安装过滤器和抽滤管，用经过处理的无菌水加满抽滤管，缓慢抽滤清洗3次后，备用。 6.2样品处理 6.2.1取待检水样50mL于灭菌采样瓶中，采样时不需要水样冲洗采样瓶。 6.2.2如果待检水样不能立即进行细菌计数，可在水样中加入1:20（V:V）甲醛溶液，至甲醛终浓 度为2%，可在4℃保存1个月。 6.3水样检测制片制备 6.3.1取固定后的水样1mL，使用抽滤装置，缓慢释放真空过滤。 6.3.2无菌吸取吖啶橙染液3mL，充分覆盖滤膜，缓慢释放真空过滤染色3~5min。 6.3.3移走滤器，空气干燥15s，用灭菌镊子取下滤膜。 6.3.4在洁净的载玻片上加1小滴无荧光镜油，贴上滤膜，滤膜载菌面朝上。 6.3.5在盖玻片上加1小滴无荧光镜油，具油面朝下盖紧滤膜，用镊子轻压盖紧滤膜，滤膜上下两 面放置不能有气泡。 6.3.6用封片剂将盖玻片4周封固，用于计数。如不能立即计数，可将制片在-20℃条件下保存2~3 周。 6.4计数和结果判断 6.4.1使用落射光荧光显微镜，蓝色激光道，紫外光波长450nm。 6.4.2镜检计数视野中的荧光菌体，发黄绿色到绿色荧光为活菌体细胞，发橙色到红色荧光为死亡 菌体细胞。 6.4.3计数10个随机视野，每个视野菌数为50~300cells为好，求平均值。若视野中菌数远大于 300cells，则将待检水样用生理盐水稀释后重新过滤染色，再进行