ICS11.020 B 41 DB22 备案号：42284-2014 吉林省地方标准 DB 22/T 2081—2014 鼠疫耶尔森菌核酸的测定 荧光PCR方法 Method of fluorescence PCR for the detection of Yersinia pestis 2014-05-04发布 2014-06-01实施 吉林省质量技术监督局发 布   DB22/T 2081—2014 前言 本标准依据GB/T 1.1-2009、GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：王玮琳、刘阳、孙舒、聂丹丹、陈光宇、刘韬、刘金华、罗雁非、郑旭 I   DB22/T 2081—2014 鼠疫耶尔森菌核酸的测定 荧光PCR法 1范围 本标准规定了鼠疫耶尔森菌核酸的测定 荧光PCR法。 本标准适用于鼠疫耶尔森菌的实验室检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的 版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 3警告 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测。培养物和废物应小心处置，并按 GB 19489中的有关规定执行。试样制备及核酸提取过程需在生物安全二级及以上实验室内进行。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR:聚合酶链反应（Polymerase chain reaction）。 DNA:脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）。 Taq酶:DNA聚合酶。 FAM:6-羧基-荧光素（一种荧光报告基团）（6-Carboxy-fluorescein）。 TTAMRA（Carboxytetramethylrhodamine）。 TE:缓冲液 (Tris-Cl EDTA) 。 Tm值:核酸融解温度（Melting tempreture）。 Ct值:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数 (Cycle threshold) 。 5原理 实时荧光PCR方法，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程， 最后通过荧光信号的增幅情况来判定反应结果。PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一条特异性荧 光探针，探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，PCR扩增时，利用Taq酶的水解作用，使探针 上的荧光报告基团远离淬灭基团而发出荧光信号，荧光检测系统可接收到荧光信号，此方法检测的是积 累荧光。TAMRA探针（Carboxytetramethylrhodamine，羧基四甲基罗丹明），是罗丹明类荧光素衍生物， TAMRA易于被mercury arc lamps 的546nm光谱线所激发，且比荧光素具有更好的光稳定性和敏感性。 6试剂与材料 1