ICS11.020C 62DB22备案号：35806-2013吉 林省地方标准DB 22/T 1673—2012 莱姆病螺旋体的检测荧光PCR法Detection of Borrelia burgdorfe——Fluorescence PCR 2012 –12–17发布2013 –01–01实施吉林省质量技术监督局发布 DB22/T 1673—2012前言本标准依据GB/T 1.1-2009、GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。本标准主要起草人：刘阳、王玮琳、丁旭、孙舒、刘韬、刘金华、牛茜、罗雁非、郑旭。I DB22/T 1673—2012莱姆病螺旋体的检测荧光PCR法警告——为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测。培养物和废物应小心处置，并按GB/T 19489中的有关规定执行。1范围本标准规定了莱姆病螺旋体荧光PCR检测方法本标准适用于莱姆病螺旋体的实验室检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T 19489实验室生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。PCR:聚合酶链反应（Polymerase chain reaction）DNA:脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）Taq酶:DNA聚合酶FAM:6-羧基-荧光素（一种荧光报告基团）（6-carboxy-fluorescein）MGB:小沟结合物（一种荧光淬灭基团）(Minor groove binder)SDS:十二烷基硫酸钠 (Sodium dodecyl sulfate)CTAB:十六烷基三乙基溴化铵（Hexadecyltrimethyl ammonium bromide）TE:缓冲液 (Tris-Cl EDTA)Tm值:核酸融解温度（Melting tempreture）Ct值:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数 (Cycle threshold)4原理实时荧光PCR方法，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，最后通过荧光信号的增幅情况来判定反应结果。PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一条特异性荧光探针，探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，PCR扩增时，利用Taq酶的水解作用，使探针上的荧光报告基团远离淬灭基团而发出荧光信号，荧光检测系统可接收到荧光信号，此方法检测的是积累荧光。MGB探针（Minorgroove binder oligodeoxynucleotide conjugate,MGB-ODN)，5′端标记FAM荧光素为报告基团，3′端采用了非荧光性的淬灭基团，吸收报告基团的能量后并不发光，降低了本底信号的干扰。此外，MGB探针的3′端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽 (Dehydrocyclopyrroindoletripetide, DPI3)，可以稳定探针与模板的杂交,升高探针Tm值,使较短的探针同样能达到较高的Tm值。1