中华人民共和国国家标准GB4789.12—2016食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB4789.12—2016前言GBT4789.12—2003《食品卫生微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验 》本标准代替 /GBT4789.12—2003相比,主要变化如下 :本标准与 /———标准名称修改为 “食品安全国家标准———增加了PCR鉴定方法;———增加了结果与报告 ;食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验 ”;———增加了附录 A;———修改了设备和材料 ;———修改了培养基和试剂 ;———修改了检验程序 ;———规范了样品制备过程 ;———修改了操作步骤中增菌和分离培养部分试验方法ⅠGB4789.12—2016食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验范围1本标准规定了食品中肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)及肉毒毒素(botulinumtoxin) 的检验方法本标准适用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的检验设备和材料2除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下 :冰箱:2℃~5℃-20℃2.12.22.32.42.52.62.72.8天平:感量0.1g无菌手术剪镊子试剂勺均质器或无菌乳钵 离心机:3000rmin14000rmin/ /厌氧培养装置 恒温培养箱:35℃±1℃28℃±1℃恒温水浴箱:37℃±1℃60℃±1℃80℃±1℃2.9显微镜:10倍~100倍2.10 PCR仪电泳仪或毛细管电泳仪 2.112.122.132.142.152.16凝胶成像系统或紫外检测仪 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 可调微量移液器 :0.2 L~2 L2 L~20 L20 L~200 L100 L~1000μLμμμ μμμ μ无菌吸管: 1.0mL10.0mL25.0mL无菌锥形瓶:100mL2.17培养皿:直径90mm离心管:50mL1.5mL 2.182.19 PCR反应管无菌注射器:1.0mL2.202.21小鼠:15g~20g,每一批次试验应使用同一品系的 KM或ICR小鼠培养基和试剂3除另有规定外 ,PCR试验所用试剂为分析纯或符合生化试剂标准,水应符合 GBT6682/ 中一级水的要求1GB4789.12—2016庖肉培养基:见A.13.13.2胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉汤(TPGYT):见A.2卵黄琼脂培养基 :见A.3明胶磷酸盐缓冲液 :见A.4革兰氏染色液 :见A.53.33.43.53.6 10%胰蛋白酶溶液 :见A.6磷酸盐缓冲液(PBS):见A.73.73.8 1molL/氢氧化钠溶液 3.9 1molL/盐酸溶液肉毒毒素诊断血清 3.103.11无水乙醇和95%乙醇溶菌酶溶液/3.1210mgmL/3.13 10mgmL蛋白酶K溶液3.14 3molL/乙酸钠溶液(pH5.2)3.15 TE缓冲液3.16引物:根据表1中序列合成,临用时用超纯水配制引物浓度为 10μmolL/3.17 10×PCR缓冲液/3.1825mmolLMgCl23.19 dNTPsdATPdTTPdCTPdGTP: 3.20Taq酶琼脂糖:电泳级3.213.22溴化乙锭或 Goldview3.23 5×TBE缓冲液3.24 6×加样缓冲液3.25 DNA分子量标准检验程序4肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序见图 12GB4789.12—2016图 1肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序操作步骤样品制备55.1样品保存5