中华人民共和国国家标准GB4789.43—2016食品安全国家标准食品微生物学检验微生物源酶制剂抗菌活性的测定2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB4789.43—2016食品安全国家标准食品微生物学检验微生物源酶制剂抗菌活性的测定范围12本标准规定了微生物源酶制剂抗菌活性的测定方法本标准适用于用微生物生产的酶制剂抗菌活性的测定设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下 :生物安全柜2.12.22.32.42.52.6冰箱:2℃~5℃恒温培养箱:36℃±1℃恒温水浴箱:46℃±1℃天平:感量为0.1g振荡器2.7无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头 2.8无菌培养皿:直径90mm无菌锥形瓶:容量250mL500mL2.92.10 pH计或精密pH试纸无菌纸片:见A.8无菌镊子2.112.122.13游标卡尺:刻度为0.1mm培养基和试剂3胰蛋白胨大豆琼脂 (TryptoneSoyAgarTSA, ):见A.1胰蛋白胨大豆肉汤 (TryptoneSoyBrothTSB, ):见A.23.13.23.3平板计数琼脂(PlateCountAgar):见A.33.4 0.1molLHCl/:见A.4无菌生理盐水 :见A.53.53.6 50.0μgmL3.7 5.0μg/片环丙沙星纸片 :见A.7/环丙沙星(CiprofloxacinCIP,)溶液:见A.6试验菌株4金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)ATCC65384.11GB4789.43—2016大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC11229蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)ATCC2环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)ATCC45164.24.34.44.54.6化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)ATCC12344粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)ATCC14041检验程序5微生物源酶制剂抗菌活性的测定检验程序见图1图 1微生物源酶制剂抗菌活性的测定检验程序操作步骤6试验菌悬液原液制备6.1将金黄色葡萄球菌 (ATCC6538)大肠埃希氏菌(ATCC11229)蜡样芽孢杆菌 (ATCC2)环状芽孢杆菌(ATCC4516)化脓性链球菌(ATCC12344)粘质沙雷菌(ATCC14041)冻存菌株分别接种于2GB4789.43—2016盛有5mLTSB的试管,置36℃±1℃培养18h~24h进行第一次传代培养,分别挑取第一次传代培养液1~2环转种于5mLTSB肉汤,置36℃±1℃培养18h~24h进行二次传代培养,作为试验菌悬液原液备用试验菌悬液原液纯度检测 :分别挑取试验菌悬液原液各一环,划线接种于TSA平板,36℃±1℃培养20h~24h,观察纯度菌悬液原液浓度测定菌悬液原液稀释6.26.2.1分别取6.1中制备的菌悬液原液依次进行十倍梯度稀释,蜡样芽孢杆菌和环状芽孢杆菌分别制成10-4稀释液,金黄色葡萄球菌 大肠埃希氏菌 化脓性链球菌 粘质沙雷菌分别制成 10-5稀释液培养计数6.2.2分别吸取6.2.1中制备好的各菌稀释液 1mL于无菌平皿内,每个稀释度做两个平行,并用无菌生理盐水作空白对照 向平皿中倾注冷却至 46℃左右(可放置于46℃±1℃的恒温水浴箱中保温 )的平板计数琼脂15mL~20mL,并转动平皿使其混合均匀待琼脂凝固后 ,将平板翻转,于36℃±1℃培养24h后计数,各菌悬液原液中菌浓度均大于106CFU/mL时方可使用检测平板制备6.3倾注融化并冷却至 46℃±1℃的TSA培养基15mL于无菌培养皿内,待其凝固后制成TSA平板,备用将6.1中二次传代后的各菌培养物分别用冷却至46℃±1℃的TSA培养基按1∶10的比例稀释(其中化脓性链球菌 ATCC12344按1∶20的比例稀释),充分混匀后各取10mL至上述已制备好于46℃±1℃中保温的TSA平板内,轻轻摇动平板使菌液均匀铺平,待其凝固后制成检测平板,备用注:为防止含菌培养基遇到 TSA后马上凝固,引起菌悬液铺板不均匀,