ICS65.020B 16DB46备案号：33827-2012海南省地方标准DB 46/ T 220—2012 槟榔苗黄化病植原体PCR检测技术规范 Technical specification for PCR detection of arecanut yellow leaf phytoplasma of seedling 2012-04-18发布2012-05-18实施海南省质量技术监督局发 布 DB46/ T 220—2012前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准的附录A为规范性附录，附录B为欧亿·体育（中国）有限公司性附录。本标准由海南省质量技术监督局提出。本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。本标准主要起草人：罗大全、车海彦、温衍生、徐雪莲。本标准首次发布于2012年4月。I DB46/ T 220—2012槟榔苗黄化病植原体PCR检测技术规范1范围本标准规定了槟榔苗黄化病植原体的检测技术规范。本标准适用于槟榔苗中槟榔黄化病植原体的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1Ct值指荧光信号有统计意义显著增长（即穿过阈值线）时的循环次数。3.2槟榔苗用成熟种果育成的实生苗，育苗时间在两年以内的苗。4原理以染色体DNA为基础的分子生物学技术已用来检测和鉴定植原体。根据16S rRNA基因保守序列设计通用引物，应用巢式PCR（nested – PCR）技术检测。根据16S rRNA基因序列设计翠菊黄化组（16SrⅠ组）植原体特异性引物/探针组合，进行实时荧光PCR的检测。5仪器设备台式高速冷冻离心机（最高转速在12000 rpm以上）、全自动数码凝胶图像分析系统、PCR仪、全自动荧光定量PCR系统、全自动灭菌器、电子分析天平（万分之一）、旋涡混合器、水平电泳装置，微量可调移液器（0.1-1000μL)。6试剂和缓冲液配制1 DB46/ T 220—2012用于巢式PCR和实时荧光PCR检测的试剂和缓冲液配制，参见附录A。7检测方法7.1槟榔心叶总DNA提取称取抽样的槟榔植株刚抽出的心叶0.5 g，加入适量液氮研磨呈粉状，再加入1 mL DNA提取缓冲液充分研磨，然后加入80 μL 10%十二烷基肌氨酸钠，混匀，在55℃温育1~2 h，4℃ 6000 rpm 离心10 min，取上清液；加入2/3体积异丙醇到上清液中，轻轻混匀，-20℃保持至少30 min，4℃ 8000 rpm离心15 min，弃上清；加入600 μL TE缓冲液、30μL 10%十二烷基硫酸钠和12 μL蛋白酶K（5mg/ml），轻轻彻底悬浮沉淀，37℃温育30-60 min；加100 μL 5M NaCl混匀，再加入84 μL CTAB/NaCl溶液混匀，65℃温育10min；加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）混匀，4℃ 6000 rpm 离心5 min，重复直至无中间白色层；取上清液，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，4℃ 6000 rpm离心5 min；取上清液，加入2/3体积异丙醇，混匀，-20℃保持至少30 min，4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清液；加入500 μL 70%乙醇洗涤，4℃ 12000 rpm离心10 min，洗涤两次；取沉淀，加入50 μL TE混匀溶解。加入5 μL RNaseA(10μg/μl)，37℃ 30 min, 除去RNA。7.2巢式PCR检测下述反应均需同时设植原体16SrDNA质粒作为阳性对照，设经确认的健康槟榔植株叶片作为阴性对照，设灭菌双蒸水作为空白对照。7.2.1引物序列引物采用植原体16S rDNA通用引物R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2，引物序列见表1。表1巢式PCR检测的引物序列引物名称R16mF2R16mR1R16F2nR16R2引物序列5’-3’CATGCAAGTCGAACGGACTTAACCCCAATCATCGACACGACTGCTAAGACTGGGCGGTGTGTACAAACCCCG7.2.2PCR反应PCR反应体系见表2。PCR反应条件为：94℃，预变性2 min；94℃变性1 min；45℃退火45s，72℃延伸1 min；共进行30个循环，最后72℃延伸10 min。以R16mF2/R16mR1作为第一引物对，R16F2n/R16R2 作为第二引物对，进行巢式PCR(nested-PCR)扩增，直接PCR以7.1中提取的总DNA为模板，巢式PCR以直接PCR产物稀释50倍后的样品为模板。PCR反应体系和反应条件与直接PCR扩增相同。表2巢式PCR反应体系组分加样量（μL）10×PCR buffer25 mmol/L MgCl22.02.52 DB46/ T 220—2012表2（续）组分加样量（μL）10 mmol/L dNTPs2.51.010μmol/L 上游引物10μmol/L 下游引物Taq DNA聚合酶（5U/μL）模板DNA1.00.21.0补灭菌双蒸水至最终反应体系25μL取5μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶（含0.5μg/ mL溴化乙锭）中电泳。利用Marker DL2000作为分子量标准，在120V电场强度下电泳约20 min，最后用全自动数码凝胶图像分析系统照相。7.2.3PCR产物序列RFLP图谱分析将第二轮PCR产物进行序列测定，序列结果利用植原体分类鉴定的在线专用数据库-iPhyClassifier（plantpathology.ba.ars. usda. gov/cgibin/resource/iphyclassifier.cgi）进行RFLP图谱分析。7.2.4结果判定巢式PCR检测结果判定见表3。表3巢式PCR检测结果判定简表判定条件第二轮PCR产物在1.2kb处是否有条带出现（见图B.1）检测样品序列的RFLP图谱分析结果与槟榔黄化病