ICS65. 020. 01 DB21 B04 辽 宁省地方标准 DB21/ T2396—2015 水稻品种抗稻瘟病基因检测PCR法 2015 -05 -18发布 2015 -07 -18实施 辽宁省质量技术监督局 发布  DB21/ T2396—2015 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由辽宁省农业科学院提出。 本标准由辽宁省农村经济委员会归口。 本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责起草。 本标准主要起草人：陆晓春、郑文静、丛玲、赵家铭、王妍、张丽霞、白春明、王春语、朱振兴、马丽、 李丹、王平、李金红等。 本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责解释。 I  DB21/ T2396—2015 水稻品种抗稻瘟病基因检测PCR法 1 范围 本标准规定了检测水稻品种抗稻瘟病基因的 PCR检测法，包括原理、仪器设备、试剂和材料、防 污染措施、实验步骤及结果分析。 本标准适用于水稻品种中抗稻瘟病基因 pita、pid2、pid3、pik、pikp、pikm、piks、pi21、pi36、pi37 和 pi5的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/ T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/ T19495. 2 转基因产品检测实验室技术要求 农业部 1485号公告-- 4—2010 转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化 3 术语及缩略语 下列术语及缩略语适用于本标准 3. 1 正向引物：处于DNA双链上游的引物，简称 F引物。 3. 2 反向引物：处于DNA双链下游的引物，简称 R引物。 3. 3 内参引物：在聚合作用起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序 列。 3. 4DNA: Deoxyr i bonucl ei caci d,脱氧核糖核酸。 3. 5Pr i meSTARHSDNA Pol ymer as e:高保真DNA聚合酶。 3. 6Pr i meSTARBuf f er（5×）:5×PCR反应液。 3. 7dNTPMi xt ur e（10mM）:单核苷酸混合液（10mM）。 3. 8PCR: Pol ymer as echai nreact i on。 3. 9TAE：Tr i s-Cl、冰醋酸、EDTA缓冲液。 1  DB21/ T2396—2015 3. 10Gol denvi ew：核酸染料，替代溴化乙锭。 3. 11DNA Mar ker：标准分子量的核酸标记。 3. 12bp: Basepai r ,碱基对。 3. 13Tr i s：t r i s( hydr oxymet hyl ) ami nomet hane，三羟甲基氨基甲烷。 4 原理 根据水稻抗病基因保守区序列设计特异性引物，提取不同水稻品种的 DNA，对试样进行 PCR扩增， 依据是否扩增获得预期大小的 DNA片段及特定的序列来判断样品是否携带该抗病基因。 5 仪器设备 5. 1 台式离心机。 5. 2PCR仪。 5. 3 凝胶成像系统。 5. 4 琼脂糖电泳槽及电泳仪等电泳装置。 5. 5 恒温水浴锅。 5. 6 分析天平：感量0. 1g、0. 01g和0. 1mg。 5. 7 具盖塑料离心管：2mL，0.2mL。 5. 8 研钵、研杵。 5. 9 移液枪和吸头：1000μL, 200μL, 10μL。 5. 10 其它相关仪器设备 6 试剂和材料 6. 1 供试水稻叶片或种子。 6. 2DNA提取试剂盒。 6. 3Pr i meSTARHSDNA Pol ymer as e。 6. 4Pr i meSTARBuf f er（5×）。 6. 5dNTPMi xt ur e（10mM）。 6. 6DNA Mar ker：可以清楚地区分 100bp～1000bp的DNA片段。 6. 750×TAE缓冲液，使用时稀释 50倍。 2  DB21/ T2396—2015 6. 8 加样缓冲液。 6. 9 引物见附录A。 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682规定的一级水。 7 防污染措施 检测过程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。 8 实验步骤 8. 1 水稻DNA提取 按农业部 1485号公告- - 4—2010 的规定执行。 8. 2PCR反应 8. 2. 1 将试样DNA、Pr i meSTARBuf f er（5×）、dNTPMi xt ur e、正向引物及反向引物及 ddHO置于冰 2 上融化。 8. 2. 2 在 0. 2mL加盖无菌离心管中，按先后顺序加入： PrimeSTAR Buffer（5×） dNTP Mixture (2.5 mM) 正向引物及反向引物(100nM) 试样DNA 6 μL 2.4 μL 0.2 μL (终浓度: 0.2μM~0.3μM )， 1 μL （20～100ng） 20.1 μL ddH2O PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5U/μL)0.3 μL 用移液枪抽打混匀，盖上盖子短暂离心，置于冰上待用。 8. 2. 3 将离心管置于PCR仪中，反应程序为： 95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 30 s，55 ℃～61 ℃退火 30 s，，72℃延伸 30 s ～60 s（每对引物 的退火温度及延伸时间参见附录 A），29个循环，72 ℃总延伸5 min，4 ℃保存。 8. 3PCR产物电泳 8. 3. 1 用200mL玻璃烧杯称取琼脂糖 0. 5g，加入 1×TAE缓冲液50mL。 8. 3. 2 杯口用锡箔纸盖好，置微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。 8. 3. 3 琼脂糖冷却至50 ℃左右时加入2. 5 μL Gol denvi ew，混匀，迅速将胶倒至模具中，放置上样梳。 8. 3. 4 待胶完全凝固后，拔下上样梳，置于盛有1