ICS65. 020. 01 DB21 B04 辽 宁省地方标准 DB21/ T2395—2015 稻瘟病菌无毒基因检测PCR法 2015 -05 -18发布 2015 -07 -18实施 辽宁省质量技术监督局 发布  DB21/ T2395—2015 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由辽宁省农业科学院提出。 本标准由辽宁省农村经济委员会归口。 本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责起草。 本标准主要起草人：郑文静、陆晓春、王世维、赵家铭、马丽、丛玲、张丽霞、白春明、王春语、王妍、 朱振兴、李丹、王平、李金红等。 本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责解释。 I  DB21/ T2395—2015 稻瘟病菌无毒基因检测PCR法 1 范围 本标准规定了检测稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）无毒基因的检测方法，包括原理、仪器设备、 试剂及样品、防污染措施、实验步骤及结果分析。 本标准适用于稻瘟病菌中无毒基因 AVR1-CO39、AVR-Pia、AVR-Pii、AVR-Pik、AVR-Pita和AVR-piz-t 的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求 3 术语及缩略语 下列术语及缩略语适用于本标准 3. 1 正向引物：处于DNA双链上游的引物，简称F引物。 3. 2 反向引物：处于DNA双链下游的引物，简称R引物。 3. 3 内参引物：在聚合作用起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序 列。 3. 4DNA：Deoxyribonucleoside tripHospHate，脱氧核糖核酸。 3. 5TE：Tris-Cl、EDTA缓冲液。 3. 6TBE：Tris-Cl、硼酸、EDTA缓冲液。 3. 7PrimeSTAR HS DNA Polymerase：高保真 DNA聚合酶。 3. 8PrimeSTAR Buffer（5×）: 5×PCR反应液。 3. 9dNTP：Deoxyribonucleoside tripHospHate，脱氧核苷三磷酸。 3. 10PCR：Polymerase chain reaction。 1  DB21/ T2395—2015 3. 11bp：Base pair，碱基对。 3. 12Goldenview：核酸染料，替代溴化乙锭。 3. 13DNA Marker ：标准分子量的核酸标记。 3. 14bp: Base pair, 碱基对。 3. 15Tris：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。 3. 16EDTA：disodium ethytene diamine tetracetace 2H2O 4 原理 根据稻瘟病菌无毒基因保守区序列设计特异性引物，提取稻瘟病菌 DNA，对试样进行 PCR扩增， 依据是否扩增获得预期的 DNA片段大小及特定的序列来判断样品是否携带该无毒基因。 5 仪器设备 5. 1 分析天平：感量0.1g,0.01g和0.1mg。 5. 2 瓷质研钵、研杵。 5. 3 具盖塑料离心管：2mL,1.5ml，0.2mL。 5. 4 移液枪和吸头：1000 μL,200 μL,10 μL。 5. 5 水浴锅。 5. 6 台式离心机。 5. 7NanoDrop 2000c 核酸浓度测定仪。 5. 8PCR热循环仪。 5. 9 琼脂糖电泳槽及电泳仪。 5. 10 凝胶成像系统 5. 11 其它相关仪器设备。 6 试剂及样品 6. 110%CTAB 6. 25M Nacl 6. 30.5M EDTA (PH 8.0) 6. 41M Tris, pH 8.0 6. 5DNA提取缓冲液。 2  DB21/ T2395—2015 6. 61×TE 缓冲液。 6. 75×TBE缓冲液。 6. 8 氯仿:异戊醇（24:1）。 6. 9 异丙醇。 6. 1075%乙醇。 6. 11Goldenview（代替溴化乙锭）。 6. 12 干燥的稻瘟病菌丝0.05g～0.1 g。 6. 13 引物 见附录A 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682规定的一级水。 7 防污染措施 检测过程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。 8 实验步骤 8. 1 试剂配制 8. 1. 110%CTAB：分别称取CTAB 10 g 和NaCl 4.1 g，加入 100mL重蒸馏水，65 ℃充分溶解。 8. 1. 25M Nacl：称取 Nacl 73.05 g，加入 200 mL重蒸馏水溶解，定容体积到250 mL, 平均分装。 8. 1. 30.5M EDTA (PH 8.0)：称取 EDTA 46.53 g，加入 200 mL 重蒸馏水，调整pH到 8.0（约需NaOH 5.5 g），定容到 250 mL。 8. 1. 41M Tris, pH 8.0：称取 Tris-base 121.9 g，加入 800 mL 重蒸馏水，将溶液冷却到室温，调整 pH 到 8.0（约需浓 HCl50 mL）并定容至 1000 mL。 8. 1. 5DNA提取缓冲液：10 mL 1M Tris pH 8.0，20 mL 5M NaCl，4 mL 0.5M EDTA及 20 mL 10%CTAB 混合，加水 46 mL定容到100 mL（现用现配）。 8. 1. 61×TE 缓冲液：1 mL 1M Tris （pH 8.0），0.2 mL 0.5M EDTA（pH 8.0），加水定容至100 mL。 8. 1. 75×TBE缓冲液：称取 Tris 27 g及硼酸13.75 g，分别加水溶解，再加入 10 mL EDTA（0.5M PH8.0）， 定容至 1000 mL，使用时稀释 10倍。 8. 2 稻瘟病菌菌丝DNA