ICS 11.220 B 41 DB11 备案号：31304-2011 北 京 市 地 方 标 准 DB11/T 819—2011 锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范 Technical protocol for diagnosis of Koi Herpesvirus Disease 2011-08-09发布 2011-12-01实施 北京市质量技术监督局 发布  DB11/T 819—2011 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由北京市农业局提出。 本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。 本标准由北京市农业局组织实施。 本标准起草单位：北京市水产技术推广站。 本标准主要起草人：王姝、徐立蒲、张振国、王静波、曹欢、贾丽、殷守仁。 I   DB11/T 819—2011 锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范 1范围 本标准规定了锦鲤疱疹病毒病（KHVD）的样品要求、临床症状及流行病学特征、PCR检测、结果判 定。 本标准适用于锦鲤疱疹病毒病的诊断。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682—2008分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7103水生动物产地检疫采样技术规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 KHV：锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus） KHVD：锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease） PCR:聚合酶链式反应（PolymeraseChain Reaction） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid） Taq酶：Taq DNA聚合酶（TaqDNA polymerase） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside triphosphate） 4样品要求 4.1水温 采集样品时的水温应在16℃～32℃。 4.2品种 采样品种为锦鲤或鲤。 4.3数量 按照SC/T 7103执行。 4.4状态 1  DB11/T 819—2011 采集的样品不得腐败。 4.5信息采集 需采集鲤或锦鲤发病情况、混养其它鱼类发病情况、采样水温等信息。 5锦鲤疱疹病毒病临床症状及流行病学特征 5.1患KHVD的锦鲤和鲤，具有下列临床症状： ——最显著的特征为烂鳃,鳃出血并产生大量黏液,鳃丝溃烂； ——体表出现苍白的块斑和水泡；鳍条和尾鳍充血；鳞片上出现血丝； ——眼球凹陷； ——口腔和腹部充血和出血。 5.2患KHVD的锦鲤和鲤，具有下列流行病学特征： ——混养池塘中,只有鲤或锦鲤（且不论大小）生病和死亡,而其它种类，如金鱼、草鱼等无此现象； ——水温在18℃～30℃时,特别是在25℃～28℃时,鲤或锦鲤大量死亡,当水温升高或降低时,死亡 现象下降或停止； ——死亡极快，一条健康鱼从出现临床症状到死只有24h～48h；死亡率极高，疾病发生后在10天内, 死亡率可达80%～100%。 6PCR检测方法 6.1试剂和材料 6.1.1水：符合GB/T 6682—2008中一级水的规格。 6.1.2KHV阳性核酸片断：由农业部指定机构提供。 6.1.3Taq酶：－20℃保存，不能反复冻融或温度剧烈变化。 6.1.4dNTP：10 mmoL/L。 6.1.5氯化镁溶液浓度：25mmoL/L。 6.1.6扩增KHV的TK基因中的409bp片断的引物：浓度为100pmoL/μL。其序列如下： KHV-TK-F: 5’-GGG-TTA-CCT-GTA-CGA-G-3’； KHV-TK-R: 5’-CAC-CCA-GTA-GAT-TAT-GC-3’。 6.1.7扩增KHV的Sph基因中292bp片断的引物：浓度为100pmoL/μL。其序列如下： KHV-Sph-F：5’-GAC-ACC-ACA-TCT-GCA-AGG-AG-3’； KHV-Sph-R：5’-GAC-ACA-TGT-TAC-AAT-GCT-CGC-3’。 6.1.8DEPC水：用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水。 6.2器材和设备 6.2.1普通冰箱和超低温冰箱。 6.2.2组织研磨器。 2