英文摘要 综述部分:注射性软组织填充材料及其研究进展 实验部分一: 实验部分二: 实验部分三: 实验部分四: 实验部分五: 正常皮肤成纤维细胞的分离!纯化和体外培养 一一一一一一一一一一一一一一一一一22 自体成纤维细胞的注射移植的存活性研究 一一一一一一一一一一一一一一一一一31 皮肤提取物对成纤维细胞抑制作用的研究 一一一一一一一一一一一一一一一一一47 体外传代对成纤维细胞性状影响的研究 一一一一一一一一一一一一一一一一一72 人成纤维细胞注射移植活体生长情况的观察研究 一一一一一一一一一一一一一一一一一81 致谢 ,.中国协和医科大学博士研究生 ;. 中文摘要 面部软组织的充填,对于整形外科学者来说,一直是一个极具挑战性的课题, 而注射性软组织填充材料的开发则是的研究难点自1957年wegneer首次报道使 用液态硅胶注射以来,注射性软组织填充材料的开发经历了一个去伪存真,良好的 愿望和客观的现实相矛盾的发展过程,至今没有很好的解决 临床上使用的软组织填充材料主要分为人工合成品,生物性填充材料和具有生 物活性的软组织填充材料人工合成品主要有液态硅胶!硅胶微粒!Arteeoll! 翻Pelast,这些材料进行面部填充的主要原理是利用机体对不降解的人工合成品的 组织反应,包括巨噬细胞反应!纤维增生!胶原增多来达到充填面部细小凹陷的目 的生物性填充材料主要包括牛胶原!纤维蛋白(Fbiarl)!透明质酸(HyaluronicAcid L岭对vatvies),这些材料因为没有生物活性,暂时驻留在机体内,都存在不同程度的 吸收问题,因此长期的临床效果都不能达到令人满意另外由于机体对上述两种材 料都存在或多或少的排斥反应,因此容易出现皮肤红肿!破溃!或引发机体的免疫 系统性疾病因此,临床期待着有良好组织相容性的软组织填充材料的出现 具有生物活性的软组织填充材料,是指既要参与体内正常的生理代谢,又具有 分泌各种生长因子和其他功能性蛋白的功能,因此也就是具有生理活性细胞的移 植目前涉及整形外科领域的主要是脂肪细胞移植!成纤维细胞移植和软骨细胞移 植自1995年以来,美国组织工程中心Hakcnesack大学医学中心整形外科的Willima K . Boss等,采用特殊的培养方法,从病人耳后切取3rnrn的皮肤,培养出自体成纤 维细胞(Iosalgen自体胶原),选择第4!5代的细胞用于充填面部细小凹陷,如鼻 唇沟!眉间纹!唇周!座疮!鱼尾纹及凹陷性瘫痕在1450例病人4800个部位的 治疗中,1年病人的满意率达92%,3一4年的满意率为70%随后进行的研究表 明,注射部位的真皮层增厚,I型胶原增加在裸鼠身上未发现明显的致瘤性据 目前公开发表的文献,未见其对机理和安全性进行深入的研究本课题就是对自体 成纤维细胞注射移植充填面部细小凹陷的可行性进行初步的探讨本试验分5个方 面进行研究 成纤维细胞是结缔组织中最主要的细胞成分,在分泌细胞外基质成分及构建细 胞外基质中扮演着重要的角色,在组织创伤修复中也发挥着重要的作用整形外科 学者对成纤维细胞的理解远远超过了其他学科成纤维细胞具有较强的分裂增殖能 力,适应性强,是较容易培养的细胞常用的培养方法有植块培养法!消化法和消 化一植块培养法临床上,我们希望以最少的组织!最快的速度获得最大量的细胞, 而这其中最为需要注意的最少量的组织这个条件,因而决定了植块法是最理想的培 养方式 为了研究成纤维细胞在体内的移植存活情况,我们以新西兰兔为研究对象,首 次采用了泊一TRd体外参入标记细胞,注射移植后体内示踪的技术,通过放射自显影 客观的观察到标记的细胞在移植后5个月依然在体内存活,为其临床效果的持久性 提供了严谨的科学证据采用天狼猩红染色的方法,观察注射部位与对照部位I! 111型胶原的变化,证实细胞移植部位111型胶原的含量增加,P<0.05,有明显的 J带. 中国协和医科大学博士研究生 统计学意义这些初步证实了自体成纤维细胞移植后能够长期存活,并且存活的细 胞能够分泌新生的工H型胶原,为我们临床开展自体成纤维细胞注射移植充填面部 细小凹陷提供了可能性 为探讨注射移植的细胞是否会在体内过度增生,我们依照Engel一Catchpole程 序,从正常皮肤提取D物质,主要成分为n型皮肤硫酸蛋白多糖(DS一PGll),分 为o.o625m岁ml,0.125mg/ml,o.25mg/ml,o.smmg/l和lm留nil剂量组,添加到体外培养的成纤维细胞中,每隔24小时取上清液,连续5天,观察细胞上清液中胶原含量 的变化,并同时动态对细胞生长情况摄影结果显示,细胞上清液中胶原含量的增 加幅度随着D物质浓度的增加而较少:各剂量组上清液胶原含量之间,P<0.01,有 明显的差别摄影显示,细胞数量也随着D物质浓度的增加而增殖的速度减慢本 研究证实了在正常的机体内存在成纤维细胞增殖和功能的负反馈调节机制,从而不 会产生注射部位成纤维细胞的异常增殖和胶原的过度分泌 细胞在注射移植前,在体外约有2个月的时间,体外的环境是否会对细胞的遗 传物质造成影响我们采用核型分析的方法和流式细胞计数对5代和10代细胞的 遗传物质进行了研究,结果表明,细胞在体外依然保持着良好的2倍体核型,细胞 生长周期在5代和10代之间没有明显的区别,从而证实了成纤维细胞作为良好的 种子细胞,是安全的,细胞的质量是有保证的 注射部位胶原的变化是由机体对移植细胞的反应造成的,还是由于成活的细胞 具备了生理功能分泌的呢我们将人的成纤维细胞注射到裸鼠体内,分别在1个月! 2个月和3个月取材,采用H一E染色和人I!m型胶原的单克隆抗体免疫组化的 方法研究,证实了成活的人成纤维细胞分泌了特异性人胶原结构,主要为m型胶原, 但也有I型胶原的分泌,并且随着时间的延长,胶原的分泌量逐渐增加从而很好 的解释了注射部位胶原改变的成因 综上所述,我们认为,自体成纤维细胞注射移植充填面部细小凹陷是可行的, 机理上是科学的,比其他面部注射性的填充材料有着无比的优越性,有可能将来解 决临床上面部细小凹陷充填的难题,如鱼尾纹!眉间纹!唇周的纵形皱纹等在此 基础上,我们提出体细胞治疗的概念:即利用成年机体内本身具有自身增殖能力的 细胞,通过体外扩增,重新回植体内,达到治疗和修复组织缺损的目的 铸;. . 中国协和医科大学博士研究生 ABSTRACT ForallthePlasticsugreon,it15anhihglyehallengetofillhetsotftissueonhteacfe, whiehofeusontheinjecstbllesotftissuefill.erSineeWegenerfirstlyrePortedtousethe liuqidsilieongelinl957,ithasgonehrtouhgeountlessdiffieultiesnadbosactlesto exPloittheinjeebatlesotftissuefiller.Evenhtose,ithdanotmdaehetsatisafctoyrand hdanotbeensolvedinthed.ya Theinjeeatblesotf一tissuemainlyineludehtemnauafetuer,theorgnaismfillernadhte activeogr丽smfille.rThemanuCaftuer,suehastheliquidsilieongel,thesilieonPartiele, ArtecollnadArtePlast,eouldeuasethehistologyreactiontoundegraatblemanuacftuer, toaumgenttheso-tftissue.TheerweremaeroPhagemigration,fiborblastpenetartionand neweollagendeposition.Theorganismfille,rofrexamPle,ZPylast,Fibarl,Hyaluornie AeidDerivatives,eouldnotpersistintheimPlnatsites,nadhadbeenersobredbythe bo,dy50htePersisetnceofcoerrctionwasnotgratiyfing.Besides,advesrereaetionto thesebaovemeniionedsubs切Lneeeanoccuronnaallegrienadnonallegriebasis.These rtnasientordurbalereactionsineludeburising,swelling,uleer,hteloealinflnunaatoyrresponses,asWellashetysestmie如munedisease.ThePlastiesurgeonnadPatinetare lookingof柳adrtohtegoodbioeomPatbiiliytmaterialsotemeger, Theactiveogranlsmsotf一issueau脚ention,whichshouldnotonlyatkePartinthe nomralP勿siologiealmetbaolism,butalsoPI盯orleinexeertingmnaygrowthafetosror ohterufnetionalPorotin,hdaotbehetlivingeellartnsPlnaattion.nIhtePersent,heteraer atfecllrtnasPlan七妓ion,fiborblastrtansPlnaattionnadeartilageeellartnsPlantationnithe Plasticsugreyrfield.Sinee1995,intheUniversiytofMedieinenadDentis甸ofNew Jerse,yDePartmentofPlasticSugre,yrHaeknesackUnivesrityMedicalCenet,rNJ, uatologouseulturedbfirbolast(Isolagen)hvaebeenutilizedsueeessufllyasaliving, dnymaicProetinerPairysestmofrdemralnadsubcunateousdefieiencies.Theautologous fiborblasteultureProeesswassatrted初tha3一mrertoauricularPunehbioP,yswhieh weerePxnadedbyPorPrietayrtissueeul仅rieete俪uqes.CellsofearlyPassages(4,5,6) weerusedtotraethtytids,dePerssedscars,subcutaneous别rt0P,hvacheierruglarities,nad laserwounds.Atoatlof4800injectionsweergivenon1450cases.Long一temrofllo-wuP nargedorfm36to48monhts.AsubjeetivePatientsatisacftionsuveryshowed92%ofthePatientsweersatisfiedwihtgradeofcoerretion.AIong一temrofllo-wuPsuvreyrevealdecontinuingimProvemenibeyondhteinitialco能etionin70%ofPatienst.Theofllo初ng studyshowedthateultuerdfiborblastweerofnetionallyactivenadProducedIagre qunatitiesofytPe1collagen.Inviortstudiesofsearofmrationpotencyofinjeeatble bfiroblastsshowedhtathteseecllsPossessednomraleollagengeleontlactioneaPaciytIn vivoexperimenstshowedhtatthatcul奴叮edfibroblasste观bitednooneogenicPorpe币es 助dinducednotumorsinnudemice.Thestu勿15desingedtodiseusshtepossibiliytof hteautologousfiborblastotaungtenthtemini#defieiencies.Thewholesutdyineludes 三中国协和医科大学博士研究生 带. . Pa州污# Thefibroblast,whichareimpo八之ntinhteconneetivetissue,seeretandconsturct hteeicrmusnateemartix,alsoatkethePrimeroleinhetwoundhealing.Plastiesurgeons hvaeknownaboutthefibroblastmoerthantheotherspeeialists.Thefibroblastsevreas htestrongcaPbailiytofPorliefration,naddaaPttothes叮ounding,50itareeasily cultuerdinvitor.Thecommoneul仅riedmethodsinvolvetheexPlanteuloter,the dissoeiatedcel