) 准学位申请人姓名:李保昌学号:012100 申请学科门类和级别:医学博士 指导教师:王全立研究员 专业名称:免疫学专业代码:100102 年级:2001级 培养单位:军事医学科学院野战输血研究所 甲 介 研究目的:anti一HCV检测对于控制HCV经输血传播,及时诊断HCV感染患者发挥 了巨大的作用。目前所用第三代ELISA检测试剂较早期试剂在灵敏度和特异性上 都有了很大提高,但在检测低感染率(<10%)人群时特异性仍不理想,阳性结果 人群中约35%(15%一60%)为假阳性,在献血员中阳性结果的预示值仅为70一80%, 造成了医疗资源和宝贵血源的很大浪费。双抗原夹心法在方法学上比目前所用间 接法特异性更好,灵敏度更高,本研究旨在建立双抗原夹心anti一HCVELISA检测 方法,以解决间接法特异性不足问题。 研究内容: 1.多表位融合重组HCV抗原基因的克隆与序列分析 选择HCV结构蛋白和非结构蛋白优势抗原表位的编码基因,以及来自HCV不 同病毒型别的抗原表位编码基因共12个,拼接成长度为1450bp的嵌合抗原编码 序列,插入pQE一30和p1npointT表达载体,分别转入M15和JM109(oE3)工程菌, 应用PCR扩增和测序证实插入序列具有正确的编码序列和正确阅读框架。 2.多表位融合重组HCV抗原的表达、纯化与活性鉴定 将M巧和JM109(DE3)工程菌诱导表达显示,融合蛋白在M巧中以包涵体形式 表达,带有6X组氨酸标签;在JMIOg中可溶性表达,氨基端带有生物素化的标签。 表达蛋白经亲和纯化后分别测定各抗原表位的分片段抗原性和生物素标签的亲和 素结合活性。结果表明重组蛋白抗原性完整,可以用于anti一HCV的检测;生物素 标签具有良好的亲和素结合活性,可用作ELISA检测的信号放大系统。 了博士学位报告:多表位触合HCV抗原的构建与双抗原夹心检测anti一HCV可行性研究 3.Anti一HCv双抗原夹心EL工SA法的建立及效果评价 用His一tagged一HCV抗原包被酶联板,以可溶性表达的biotin一tagged一HCV作 为夹心抗原,Str即tav1din一HRP用作显色用酶标记物建立了双抗原夹心法。 结果显示,方法具有极好的特异性,400份阴性血清无一例假阳性; 接法检测阳性的标本中,有12份标本双抗原夹心法检测阴性,这 RT一PCR及RIBA确证试验均为阴性。 结论:目前anti一HCV的检测国内外均只有间接ELISA法,本文选取 临床350 应用 份间 12份标本经 优势表位和不同型别抗原表位, 抗原去除了与检测无关的序列, 构建了多表位融合重组HCv抗原。 HCV各抗原的 优势表位融合 避免了非特异反应的发生;同时由于兼顾了不同 HCV型别差异,也会使检出率有所提高。带有生物素标签的融合抗原克服了分片段 抗原联合应用时难以掌握配比及酶标记对抗原活性影响等难题,使双抗原夹心检 测anti一HCV得以实现。本研究所建立的双抗原夹心ELISA检测法的特异性远高于 目前广泛使用的间接法,双抗原夹心法能同时检测IgG、IgM和工gA抗体,提高了 检出率,应用Biotin--avidin这一成熟稳定的信号放大系统提高了方法灵敏度。如 用于anti一HCV筛查,可以显著降低宝贵血源的浪费,并减少临床误诊率,节约医 疗资源:并有可能代替昂贵复杂的RIBA,成为简便易行的anti一HCV确证试验。 关键词:丙型肝炎病毒,ELISA,抗体,嵌和抗原 踌博卜学位报告:多表位融合HCV抗原的构建与双抗原夹心检测anti一HCV可行性研究 ExPressionofaHCVmulti一ePitoPeantigenandstudyonthefeasibility ofadouble一antigen一sandwichELISAtodeteetanti一HCV (ABSTRACT) Objeetives:ELISAProvidethemainaPProaehforthediagnosisofHCVinfeetion,but 矛allthePresentELISAkitsuseamixtureofCore,NS3,NS4andNSSas antigens,andanti一humanIgG一H即aseonjugate.AmongPoPulationswith caPture a10w 云 Prevalenee(<10%)ofinfeetion,theProPortionoffalse一Positiveresultsaverages35%, henee,it15imPortantandurgenttodeveloPamoresPeeifiemethod.Theabove Problemsmaybeovereomebyusingdouble一antigen一sandwiehELISAmethod,whieh showedhighsensitivityandsPeeifieity. Studydesignandrusults:Toestablishadouble一antigen一sandwiehELISAsystem,a multiPle一ePitoPefusionantigenwhieheontainstheinununodominantePitoPesfromthe HCVs加etural(Core,EnveloPe)andnonstruetural(N53,NS4,NSS)and genotyPe一sPeeifieregionswaseonstruetedandexPressedinPQE30veetorand PinpointTMxa一1Tveetor,withitsN一terminaleotmeetedtoa6XHistaganda biotinatedtag,resPeetively.Deteetion初thPositiveseraeontainingonlyantibodytoa singleantigensegmentindieatedalltheePitoPesinthereeombinantProteinretained theirantigenieity. AffinityPurified6XHis一taggedmultiPle一ePitoPefusionantigenwasimmobilized ascaptureantigen,biotin一taggedantigenthenreaetedwitheapturedanti一HCVin PositivesamPle,withStrePtavidin一HRPaseonjugatetorePorttheruselts.400samPles fromhealthyblooddonorsweredeteetedwithnofalsePositive.Whenthe double一antigen一sandwiehELISAwereusedtodeteet350samPleswhiehhadbeen rePortedanti一HCVPositivebyindireetELISA,12samPlesshowednegative.This12 samPlesweretestedwithmoresPeeifiemethodssuehasRT一PCRandreeombinant immunoblotassay(RIBA),andallofthemremainednegative.Theresultsindieatedthat thedouble一antigen一sandwichELISAweeatablishedwasverysPeeifie. Conelusion:False一ositiveresultsduetotheumatoidfactor,hyPerglobulinemiaand 犷博士学位报告:多表位融合HCV抗原的构建’j双抗原夹心检测anti一HCV口丁行性研究 non一sPeeifieantibodytoC100antigenandfusionProteinSODhaPPensoeeasionally witheurrentlyusedindireetELISA.TOresolvethisProblem,amoresensitiveand sPeeifiedouble一antigen一sandwichELISAmaybehelPful.Sineeit15diffieulttomixthe individualantigensinequalmolaramountsandean’tlabelsomeinsolublereeombinant antigenwithenzymes,itwillbehelPfultoexPressareeombinantPolyProteineontaining allneeessaryimmunodomins.Preliminarystudiesindieatethatthenew double一antigen一sandwiehELISAbasedonthemultiPle一ePitoPefusionantigen15very sensitiveandsPeeifie.Highersensitivitymaybeobtainedbeeauseantibodiesother thanIgG(PartieularlyIgM)eouldalsobedeteetedbythismethod,andthismayshorten thePeriodfrominfeetiontodiagnosis. Kcywords:hePatitisCvirus,ELISA,antibody,chimerieantigen 矿 f博t:学位报告:多表位融合HCV抗原的构建与双抗原夹心检测anti一HCV可行性研究 目录 引言 第一部分HCV优势抗原表位融合基因的克隆与序列分析 优势抗原表位基因的选择”’‘”””””””“’“‘”“””‘’‘”‘’“’‘’“‘ 优势表位基因的克隆、合成与拼接 阳性克隆的挑选、鉴定与序列分析 结果 讨论 第二部分HCV多优势表位融合抗原的诱导表达纯化与抗原性鉴定 阳性菌的诱导表达及条件优化 融合蛋白抗原性鉴定及生物素标签活性鉴定 目的蛋白的纯化‘”””””””” 融合蛋白的分区段抗原性鉴定 小结 第三部分双抗原夹心EIA检测anti一HCV方法的建立及效果评价 双抗原夹心anti一HCVELISA检测方法的初步建立与条件优化 方法的临床应用及方法学评价 临床标本检测””””””””‘’ 与间接法不符合标本的RT一PCR检测”’‘” ChironR工BAHCV3.05工A辛卜充确证试验’“‘’ 结果 讨论 小结 总结