ICS 65.020.20B16DB32备案号：60524-2018江苏省地方标准DB32/T 3487—2018黄瓜绿斑驳花叶病毒苗期检测技术规程Technical Specification for the Seedling Detection of Cucumber Green MottleMosaic Virus2018-11-09发布2018-11-30实施江苏省质量技术监督局 发布DB32/T 3487—2018前言本标准按 GB/T 1.1—2009《标准化工作导则第 1部分：标准的结构及编写》的规定编写本标准由江苏省农业科学院提出并归口本标准起草单位：江苏省农业科学院本标准主要起草人：程兆榜任春梅季英华杨柳缪倩周益军IDB32/T 3487—2018黄瓜绿斑驳花叶病毒苗期检测技术规程12范围本标准规定了苗床期瓜苗黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测条件检测技术结果判定和结果记载本标准适用于苗床期症状尚未表现的瓜类作物上黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件其最新版本（包括所有的的修改单）适用于本文件GB/T 35335黄瓜绿斑驳花叶病毒病监测规范SN/T 2964植物病毒检测规范3检测条件3.1主要试剂磷酸氢二钠（Na2HPO4）磷酸二氢钾（KH2PO4）氯化钾（KCl）氢氧化钠（NaOH）碳酸氢二钠（Na2HCO3）氯化钠（NaCl）叠氮化钠（NaN3）PVP-400鸡卵清蛋白无水亚硫酸钠（Na2SO3）吐温-20焦碳酸二乙酯（DEPC）溴百里酚蓝乙二醇Tris碱Tris-HCl硼酸EDTA无水乙醇琼脂糖DIG DNA Labeling KitCGMMV抗体PCR试剂和检测过程中所需溶液配方参见附录 A除另有规定外所用试剂均为分析纯或生化试剂3.2用具及仪器用具耗材：移液器一次性手套牛皮纸袋标签纸记号笔等仪器设备：高压灭菌锅培养箱高速冷冻离心机（规格：-6℃~ 20℃最高转速 12000转/分以上）电泳仪（规格：电压 50~120 V电流 10~800 mA）PCR仪凝胶成像系统超纯水仪4检测技术4.1采样方法4.1.1采样时间待检材料为嫁接或未嫁接的黄瓜西瓜甜瓜南瓜等瓜类作物幼苗采样时间为出厂定植前3天~7天植株处于2片~4片真叶期4.1.2采样部位植株最上部半展开-展开的心叶心叶未达要求时取位于心叶下部一张完全展开叶4.1.3取样方法五点法取样一株为一个样本不同品种或同一品种不同时间播种的为不同批次每批次样本数量不小于 200株或同批次苗的0.1%样本采集时使用一次性手套单株采集并临时保存在一次性手套中1DB32/T 3487—20184.1.4样品处置取样后叶片一分为二一半为检测样品一半为留存样品样品用吸水纸包裹置于透气牛皮纸袋中新鲜检测样品在 4℃下临时保存3天内检测完毕如不能在3天内检测则将样品于-20℃的条件下冰冻保存留存样品室温下荫干-20℃的条件下冰冻保存一年后确认不再需要时焚烧或深埋处置4.2检测方法4.2.1样品处理称取0.1 g待检样品叶片加入适量液氮充分研磨成粉末后加入10倍体积的通用样品处理缓冲液（见附录 A）溶解10000转/分离心5分钟上清即为样品提取液同一批样品中加入具典型斑驳花叶症状并经 PCR法鉴定确认为CGMMV的病样稀释 1000倍为阳性对照经PCR法确认无 CGMMV的健康叶片为阴性对照4.2.2免疫捕获4.2.2.1用碳酸盐包被缓冲液（见附录 A）稀释黄瓜绿斑驳花叶病毒的抗血清500倍取稀释后的抗血清 30μL包被PCR管4℃孵育过夜或37℃下放置 2h4.2.2.2弃包被缓冲液用洗涤缓冲液（见附录 A）洗涤 3次~4次加入50μL样品提取液37℃孵育2h4.2.2.3弃样品提取液用洗涤缓冲液洗涤 3次~4次再用无菌去离子水洗一次吸尽管底余液后直接在包被了病毒的 PCR管中进行反转录4.2.3反转录4.2.3.1CGMMV特异性引物的设计及合成根据CGMMV分离物（Genbank序列号DQ217778）序列设计一对用于扩增 CGMMV-cp基