ICS01.040.67B50/59DB21辽宁省地方标准 DB21/T 2628—2016 鱼类物种鉴定PCR-RFLP结合基因芯片 分析法 the identification of fish species—the method of PCR - RFLP combined with gene chip 2016-05-09发布2016-07-09实施辽宁省质量技术监督局 发 布DB21/T 2628—2016前言本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第一部分标准的结构和编写》给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：大连出入境检验检疫局。本标准主要起草人：闫平平、齐欣、田卓、崔妍、徐文英、刘莹、曲世超、尚宝玉、陈溪、黄大亮。本标准系首次发布的地方标准。IDB21/T 2628—2016鱼类物种鉴定PCR-RFLP结合基因芯片分析法1范围本标准规定了远洋捕捞鱼类和沿海地区经济鱼类物种鉴定方法PCR-RFLP结合基因芯片分析法的技术规范要求。本标准适用于鱼体肌肉组织，鱼糜及其鱼制品中鱼基因组的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 27025 检测和校准实验室能力的通用要求GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1物种物种是生物分类学的基本单位，也是生物繁殖的基本单元。物种是互交繁殖的相同生物形成的自然群体，与其他相似群体在生殖上相互隔离，并在自然界占据一定的生态位。3.2PCR-RFLP polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism限制性片段长度多态性聚合酶链式反应3.3基因芯片基因芯片也叫DNA芯片、DNA微振列、寡核苷酸阵列。基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上,借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。4抽样与制样将实验室样品粉碎，充分混匀后待用。5防污染措施PCR检验过程的防污染措施应符合GB/T 27403的规定6原理1DB21/T 2628—2016RFLP是根据不同品种基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点直接发生了碱基的直接插入、缺失，导致酶切片段大小发生变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种的 DNA水平的差异，多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。PCR-RFLP的基本原理是 PCR 扩增目的 DNA扩增产物在有特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在基因芯片分析仪上分辨，不同等位基因的限制性酶切位点分布不同， 产生不同程度的 DNA片段条带。7仪器设备7.1电子天平：感量0.001g7.2台式离心机（最高转速15000g），台式小型离心机7.3双温水浴锅（37℃±1、65℃±1）7.4漩涡振荡器7.5低温冰箱（2℃-8℃）、冷藏冷冻冰箱（-20℃）7.6荧光PCR仪;7.7高压灭菌锅7.8实时荧光PCR仪7.9芯片电泳仪(2100生物分析仪)。7.10微量可调移液器及配套吸头8主要试剂除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和Dnase的分析纯或生化试剂。条件许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收、储存应符合GB/T 27025 的规定。8.1DNA提取试剂盒8.2PCR-RFLP鱼种鉴定试剂盒(包括 PCR扩增试剂盒和限制性内切酶酶切试剂盒)，试剂盒内包括细胞色素b基因特异性片段扩增用2×PCRMaster Mix、PrimerMix、dH2O、限制