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版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准! "!"#!"!! !""#牛 温 氏 附 红 细 胞 体 聚 合 酶 链 式 反 应操 作 规 程! "$%&'&(&)&*+&),-.%/0.(1/23%./('2&3 $45 *&%!"#$%&'$()((*+#*%(*,!""#6$!6!%发 布!""&6"#6"$实 施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售!"!#!"!!"!""#前 !!言!!本 标 准 的 附 录!为 规 范 性 附 录!本 标 准 由 国 家 认 证 认 可 监 督 管 理 委 员 会 提 出并 归 口!本 标 准 起 草 单 位 "中 华 人 民 共 和 国 上 海 出 入 境检 验 检 疫 局 #华 中 农 业 大 学!本 标 准 主 要 起 草 人 "李 树 清 #胡 永 强 #赵 俊 龙 #王 巧全 #陈 志 飞 #杜 凯 #王 贵 强 #刘 焕 章!本 标 准 系 首 次 发 布 的 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标准!! 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售!"!#!"!!"!""#牛 温 氏 附 红 细 胞 体 聚 合 酶 链 式 反 应操 作 规 程$!范 围本 标 准 规 定 了 温 氏 附 红 细 胞 体 聚 合 酶 链 式 反应 方 法!本 标 准 适 用 于 温 氏 附 红 细 胞 体 的 鉴 定 和 检 测 !!!概 述温 氏 附 红 细 胞 体 $&是 附 着 于 牛 的 红 细胞 或 游 离 于 胞 浆 的 一 种立 克 次 氏 体 %可 通 过 吸 血 昆 虫 #螨 虫 #母 体 胎 盘 #血 液等 传 播 !牛 感 染!"#$%&'$()((*+#*%(*,!-+#*%(*,%!-+#*%(*,一 般 不 表 现 临 床 症状%严 重 感 染 引 起 发 热 #消 瘦 和 黄 疸 !本标 准 根 据 !-+#*%(*,"#$%&'!的 保 守 序 列 %设 计 了 一 对 特 异 引 物()*'()&+%通 过 ,-&反 应 可 扩增 出 .+/01的 片 段 %用 于 温 氏 附 红 细 胞 体 的 鉴 定 和 检 测!%!设 备 和 材 料%2$!仪 器 设 备%2$2$!,-&扩 增 仪!%2$2!!电 泳 仪!%2$2%!凝 胶 成 像 系 统!%2$2&!微 波 炉!%2$2'!可 调 移 液 器 $3 4"54"55 4355 4"5554%% % %&!"""""%2$2(!离 心 机!%2$2#!天 平$52555"6&!%2$2)!水 浴 锅!%2!!耗 材%2!2$!,-&反 应 管!%2!2!!"27(4离 心 管!%2!2%!移 液 器 滴 头!%2%!试 剂%2%2$!三 蒸 水 52"5+8,9灭菌%2%2!!琼 脂 糖!"7(:;!%2%2%!溴 化 乙 锭!%2%2&!./0酶$7<4'"&!%2%2'!"5=,-&反 应 缓 冲 液!%2%2(!氯 化 镁$86-> 37((?>4&3' !%2%2#!"((?>'4@'A,!%2%2)!苯 酚三 氯 甲 烷B异 戊 醇$B37C3DC"&!%2%2*!分 子 量 指 示 物 ""5501#355501E'!89%FG%%2%2$"!75(6'(4溶 菌 酶 #"5H$E$"5(6(4蛋白 酶 I7(?>4基 溴 化 铵 $'乙 酸 钠 $ 乙 醇 # 溴 化 乙 锭$!#'#' 氯 化 钠 $十 六 烷 基 三 甲'9-> 7H&#-A!J 3(?>4 '9!K .5H"5(6(4&#&#'LJ&#A%:MB乙 酸 电 泳 缓 冲" 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售!"!#!"!!"!""#液$&#A!L "27H琼 脂 糖 凝 胶 ##=加 样 缓 冲液 #+2/H柠 檬 酸 钠 #"27H乙 二 胺四 乙 酸 二 钠 $LEA!二 钠&的 配 制 见 附 录!!除 另 有 规 定 %所 用 化 学 试 剂 均 为 分析 纯!%2&!引 物引 物 序 列 见 表 "!引 物 用 灭 菌 三 蒸 水配 成 "55 (?>4' 母 液 %N35O冻 存!使 用 时 用 灭 菌 三 蒸 水 配"成' 的 工 作 液!7 (?>4"表$!试 验 所 用 引 物 序 列引 物核 苷 酸 序 列引 物 浓 度 '$(?>4"' &引 物 位 置产 物 大 小 '01"5#B"+3%3.01$!RSD#3##&9()*7PB6Q99Q9K9Q9QQQ99KQQ9KQQQQ9K6B+P7.+//3#B/D+%"/01$!RSD#3##&0()&+7PB96K9KQK69KQ969Q6QKB+P7!!上 游 引 物T?%)9%@1%:(G%9!!!下 游引 物%GUG%MG1%:(G%0!&!操 作 步 骤&2$!样 品 采 集无 菌 采 牛 血 %用 +2/H柠 檬 酸 钠 或 "27HLEA!二钠 抗 凝 作 为 临 床 检 测 样 品!&2!!样 品 处 理D55 4抗 凝 血 加 "5 4溶菌 酶 $75(6(4&涡 旋 混 匀 %'+.O下 温 育 "V(加 入 .5 4"5H$E$#4%""""蛋 白 酶I"5(6(4#7O下 温 育 "5(:;(加入 "55 47(?>4' 氯 化钠%"$'&%下 温 育"#5 4-A!J#7O%""5(:;(加 入 等 体 积 的 苯 酚三 氯 甲 烷B异 戊 醇抽 提 %</div>
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