马病毒性动脉炎微量血清中和试验操作规程Aprotocolofmicro-serumneutralizationtestforequineviralarteritisSN／T1142—2002前言本标准是参考国际兽疫局的标准(《诊断方法和疫苗标准手册》2000年，第四版)，并参考《中国进出境动物检疫规范》手册和美国国家兽医实验室的标准程序编写、制定。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国青岛出入境检验检疫局。本标准起草人：梁成珠、朱来华、徐彪、吴华。本标准系首次发布的出入境检验检疫欧亿·体育（中国）有限公司标准。1范围本标准规定了马病毒性动脉炎微量血清中和试验方法。本标准适用于马病毒性动脉炎中和抗体水平的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。国际兽疫局《诊断方法和疫苗标准手册》2000年，第四版3仪器设备3333....1超净工作台或生物安全柜。2二氧化碳培养箱。3倒置显微镜。4液氮贮存罐。3333....5蔡氏滤器和微孔滤膜(0.22μm)。6蒸汽消毒器。7微量细胞培养板(96孔)。8微型振荡器。333...9可调微量移液器和吸嘴(200μL)。)。110电子天平(0.1mg～2500g1吸管(1mL、2mL、mL、10mL)。4试剂4.1抗生素贮存液用灭菌双蒸水配成每毫升含100000IU青霉素和10mg链霉素的贮存液，用微孔滤膜(0.22mL／瓶，-20℃冻存备用。保存期不超过60d。5％碳酸氢钠溶液g碳酸氢钠4.27.7.5(A.R.)溶解于10mL双蒸水，用微孔滤膜(0.22μm)过滤除菌，分装成mL／瓶，4℃冷藏备用。保存期不超过60d。 4.3细胞消化液(0.02％EDTA)EDTA(乙二胺四乙酸二钠：氯化钠氯化钾Versense)(A.R.)0.8.0.1.150.2O2ggggg(A(A.R.R..))磷酸氢二钠(A．R．)磷酸二氢钠(A．R．)2加双蒸水至1000mL，充分溶解，分装成小瓶，115℃高压灭菌10min，4℃冷藏备用。保存期不超过90d。4.4病毒株和细胞系6℃(液氮)冻存备用。1马病毒性动脉炎病毒2兔肾细胞)。-194444....4.(EquineArteritisVirus，EAV)(Bucyrus株)。4.(RK-135细胞培养液和维持液55.1细胞培养液0％灭能的无菌胎牛血清2细胞维持液2％灭能的无菌胎牛血清含1(FBS)的MEM培养基。4..含(FBS)的MEM培养基。细胞培养液和维持液均用微孔滤膜(0.22μm)过滤除菌，分装成小瓶，4℃冷藏备用。保存期不超过60d。使用时加1％抗生素贮存液(终浓度为每0μg)，并用5％碳酸氢钠溶液调pH值至0～2。毫升MEM培养基含青霉素100IU和链霉素107.7.7.4.6补体无菌采集健康豚鼠血液，分离血清，分装成10mL一瓶，-20℃冻存备用。保存期不超过30d。44444.....7病毒稀释液(10％补体的细胞培养液)8血清(应在56℃灭能30min)888...1标准阳性血清(-20℃冻存备用))2标准阴性血清3被检血清(-20℃冻存备用无菌采集被检动物血液，分离血清，不加任何防腐剂。5操作方法55..1中和病毒滴度(TCID)测定501.1中和病毒制备将保存于液氮中的标准种毒EAVBucyrus株取出置于4℃缓慢融化，将融化的种毒用维持液作60倍稀释后，取1mL接种于长满成单层RK-13细胞的细胞瓶中，吸附1h。先用维持液洗涤一次，再加入维持液，放置于37℃恒温箱中培养36h～48h，当50％～75％细胞出现CPE，即可收获病毒培养液，分装成1mL后冻存(-70℃以下)备用。5.1.2病毒滴度测定在微量细胞培养板(96孔)每孔加25μL细胞培养液，用病毒稀释液将冻存病毒作0μE(细胞圆缩、脱离、裂解)，记录试验数据。10-1，10-2……10-8系列稀释，每一稀释度的病毒接种八孔，每孔4／0μL)，置37℃培养，h后初判，h终25μL。正常细胞对照，四孔至八孔不加病毒，仅加25μL病毒稀释液。每孔判。如细胞对照正常，接种病毒的细胞出现10LRK-13细胞(5×10104872CP根据Karber法计算该批病毒的毒价(半数组织感染量TCID)。505.2微量中和试验 在96孔细胞培养板上每孔加25μL细胞培养液。第一列四孔作被检血清(毒性)对照，每孔加5μL。被检血清，混匀后吸出25μL至第三孔，依次倍比稀释到第四孔，即血清稀释为D50(无病毒)作被检血清(毒性)对照，第二至四列的各孔加h。阴、阳性血清对照(方法同上)。病毒滴度验证试验，将工作浓度的中和病毒再作3稀释，再加25μL病毒稀释液，每一稀释度各四孔。正常细胞对照，留四孔至八孔，每孔仅加5μL的病毒稀释液，不加血清和病毒。上0μ13细胞，细胞浓度为0)μL。放二氧化碳保湿培养箱5％二氧化碳7℃培养，h用倒置显微镜进行初步判定，4／25μL被检血清，用移液器混匀后弃:2、:4和:8，每一稀释度各四孔。用病毒稀释液5μL稀释的病毒。盖上培养板，25μL；第二列四孔，每孔加将病毒稀释成工作浓度2111200TCI，第一列四孔加病毒稀释液2轻轻摇匀，放二氧化碳保湿培养箱(5％二氧化碳