橡胶南美叶疫病菌检疫鉴定方法Methodsforthequarantineandidentificationofsouthamericanleafblight[Microcylusulei(P.Henn.)VonArx]inrubbertreeSN／T1106—2002前言橡胶南美叶疫病是我国进境植物检疫危险性病害。为了防止该病菌随寄主传人我国，需正确掌握橡胶南美叶疫病菌的检疫鉴定方法。本标准在制定过程中，分析了国内外有关欧亿·体育（中国）有限公司，总结了多年来植物检疫经验，根据橡胶南美叶疫病菌的形态学、生物学特性及植物病理学原理，确定各项鉴定技术指标。本标准给出橡胶南美叶疫病菌的有性态和无性态的形态特征，以及在寄主上所表现的病征和病状，鉴定时可以综合采取有性态和无性态的形态特征，或者其中的一个世代的形态特征作为鉴定依据。本标准的附录A为欧亿·体育（中国）有限公司性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本标准主要起草人：林石明、余芳平、陈勇。本标准系首次发布的出入境检验检疫欧亿·体育（中国）有限公司标准。1范围本标准规定了进境植物检疫中橡胶南美叶疫病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进境三叶橡胶属(Heveaspp.)植物的芽条、芽穗、蒴果等繁殖材料的橡胶南美叶疫病菌的检疫鉴定。2原理橡胶南美叶疫病菌是活体营养真菌，可以侵染三叶橡胶的叶片、枝条、茎杆、花序、蒴果，造成橡胶树的持续落叶。该病菌有3种类型的繁殖体，即子囊孢子、器孢子和分生孢子。该病菌可依据其极具扭曲的无性态的分生孢子特征，有性态的形态特征和生物学特征，以及在三叶橡胶属植物上的症状特征进行鉴定。3仪器、试剂33333.....1手持式扩大镜。2双目解剖镜0×～3显微镜00×～1004切片机。(150×)。0×)。(15小器具和器皿：刀片、解剖刀、解剖剪、铗子、记号笔、酒精灯或煤气灯、纱布、烧杯、搪瓷杯、移植接种针、移植环、培养皿、烧杯、三角瓶、玻片、盖玻片、铝铂纸、Parafilm膜等。33333.....6超净工作台。7乳酚油：由苯酚(由水浴加热融化)20mL、甘油40mL、乳酸20mL、蒸馏水20mL混合配制而成。8次氯酸钠。9酒精。10琼脂。4现场检疫查验待检货物的有关单证，核实产地、包装、唛头、品名及数量。逐件检查橡胶树繁殖材料的芽条、芽穗、蒴果等是否有可疑疫情，重点应检查叶片。对于来自疫区的材料，还应仔细检查装载交通工具和包装材料。然后，直接扦取有可疑症状的部位；如果没有发现任何可疑症状，则按5％的繁殖材料比例扦取样品，带回实验室检查；如果样品数量少于10件，则全部扦取。5检验方法 5.1症状检查仔细检查橡胶的叶片、枝条、茎杆和蒴果尤其是嫩叶是否有橡胶南美叶疫病感病症状。该病的病斑通常有半透明的榄绿色斑点，暗淡青灰色或发黑，穿孔。叶片卷曲，畸形，皱缩变黑呈火烧状。病斑的背面灰白色，其上密生绒毛物(即分生孢子梗和分生孢子)，病斑的四周轮生小黑点(即分生孢子器或子座)。叶柄呈螺旋状扭曲。花序变黑、卷缩。枝条、茎杆坏死。果实上有隆起的褐色病斑。在感病组织上，最常见是散生的分生孢子梗和其上所产生的分生孢子。5.2病原菌检查用解剖针挑取或刀片刮取病斑上的绒毛状物，制片，在显微镜下直接检查有无病菌的子实体，记录其形态特征，必要时还应测量分生孢子梗和分生孢子的大小。在解剖镜下检查可疑病斑上的小黑点，切取带有病菌子实体的组织，用冰冻切片机或手工将组织切成厚度约为10μm～20μm的薄片，制片，在显微镜下检查子囊壳和／或分生孢子器，记录形态特征，并测量大小。5.3分离培养如果发现可疑症状，或没有发现该病菌的任何子实体，应采取分离、培养的方法作进一步鉴定。直接刮取病斑上的分生孢子放入HMA培养基(参见mi附录A.2)培养，或选择新鲜病组织(叶片、枝条或蒴果的表皮组织)，切成小块，用70％酒精消毒几秒钟后，置于3％次氯酸钠水溶液中消毒in，再用灭菌水连续泡洗3次，用灭菌滤纸吸干水分后移置在HMA培养基平板上、于24℃～28℃下培养。5n～15m6鉴定特征66..1形态特征1.1有性态子囊壳阶段l[Mi]，属子囊菌门cro(Acysccolmusyculoteai()，座囊菌目P.Henn.)(DVonoAthidrxeinalMüs)，小球腔菌科ller＆VonAr(Mx；=DycosotphhideaerellallulaeceaeiP·Henn.；=Mel)，小环座囊菌属an(MosicpsarocymmopsissSaulecei.，0μm～(PSy.Henn.)d.＆SPt.aSheecluyd.，1904)。其形态特征为：子座球形或近球形，碳质，表生于叶片或植物组织上，通常聚生，有时着生于穿孔病斑的周围，直径20450μ0μ)μm，具8个近双行排列的子囊孢子。子囊孢子2个细胞不相等，较长的一端顶端较尖，朝下排列，大小为2～)μm×(2～5)μm。参见附录A之图m，但常侧面融合；拟薄壁组织的细胞壁均匀加厚，色暗；子座内有一个至多个腔·成熟时具乳突状孔口。子囊壳散生，具乳突状孔口，内径10m～200μm。子囊从腔的基部长出，有侧丝，双层壁，棍棒形，顶端稍厚，大小为(50～80)μm×(12～16无色透明，单隔膜，分隔处缢缩，近椭圆形，(120A..1。611..2无性态该病菌有两种类型，一类是分生孢子器和器分生孢子，另一类只产生散生的分生孢子梗，其上着生分生孢子。6.2.1橡胶离球壳菌(AposphaeriauleiP.Henn.)分生孢子器黑而发亮，碳质，圆形或椭圆形，表生，具乳突状孔口，直径为120μm～160μm，单腔，薄壁，由浅褐色、厚壁的角细胞组成外层，由2～)μm×(2～3)μm。产孢细2个～3个油滴，单胞，大小为(6～)μ更薄的、无色透明的小细胞组成内层，孢子梗由分