中华人民共和国国家标准食物中烟酸的测定方法GB/T 12395—90Method for determination of niacin in foods━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━1主题内容与适用范围本标准规定了用微生物方法测定食物中的烟酸含量。本标准适用于各类食物中烟酸的测定。2原理某一种微生物的生长,必需某些维生素,例如 L.arabinosus17-5之生长需要烟酸,培养基中若缺乏这种维生素该细菌便不能生长。在一定条件下,该细菌生长的情况,以及它的代谢物乳酸的浓度是与培养基中该维生素含量成正比的,因此可以用酸度或浑浊度的测定法来测定样品中烟酸的含量。本方法检出限为 10ng。3试剂本实验所用之水均需蒸馏水。所用试剂均需分析纯。3.1甲苯。3.2盐酸: 3mol/L溶液。3.3盐酸: 1:5(V/V)溶液。3.4硫酸: 0.5mol/L溶液。于2000mL的烧杯中先注入700mL水,将28mL硫酸沿烧杯壁慢慢倒入水中,用水稀释至 1000ml。3.5冰乙酸: 0.02mol/L溶液。3.6氢氧化钠: 40％溶液。溶 200g氢氧化钠于水中,稀释至500mL。3.7氢氧化钠: 0.1mol/L溶液。溶4g氢氧化钠于水中,稀释至1000mL。3.8乙醇: 25％(V/V)溶液。3.9酪蛋白:不含维生素。3.9.1不含维生素酪蛋白的制备3.9.1.1乙醇处理法: 称取 100g酪蛋白细粉于烧瓶中,加入300mL95％乙醇,在水浴中加热回流 1h,减压抽滤,弃去滤液,再加入乙醇回流,如此反复 3～4次,至滤液呈微黄色或无色,取出在烘箱内 70～80℃干燥即可。3.9.1.2酸洗法: 称取 250g酪蛋白,置于5L容器中,慢慢加入3.6L水以防止成块,加入浓盐酸 2.77mL,搅拌浸泡 3min。用虹吸管除去上层清液。加入 3.6L水,再加入浓盐酸 2.77mL,如此反复 8次后,再加水3.6L,加入 55.5mL12mol/L氨水,放置过夜,使酪蛋白溶解成浆状。用布过滤,于滤液中慢慢加入约 50mL3mol/L盐酸,调至pH4.5,使酪蛋白全部沉淀,过滤。弃去滤液,用 50～60℃热水冲洗数次,挤压去水,放入烤箱内于 100℃烤干即可。3.10酸解酪蛋白: 称取 50g 不含维生素的酪蛋白于 500mL 烧杯中,加 200mL3mol/L盐酸,于压力蒸汽消毒器内 10.3×14**4Pa(151b/in**2)压力下水解 6h。将水解物转移至蒸发皿内,在沸水浴上蒸发至膏状。加 200mL水使之溶解后再蒸发至膏状,如此反复3次,以除去盐酸。注意每次蒸发时不可蒸干或使之焦糊,因为蒸到这样程度,水解液所含营养物已被破坏。用 40％氢氧化钠调节 pH至3.5,以溴酚蓝作外指示剂。加 20g活性炭,振摇,过滤。如果滤液不呈淡黄色或无色,可用活性炭重复处理。滤液加水稀释至500mL,加少许甲苯于冰箱中保存。3.11胱氨酸、色氨酸溶液: 称取 4gL-胱氨酸和1gL-色氨酸(或 2gDL-色氨酸)于 800mL水 中,加热至 70～80℃,逐滴加入 1:5(V/V)盐酸,不断搅拌,直至完全溶解为止。冷至室温,加水稀释至 1000mL。加少许甲苯于冰箱中保存。3.12腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液:称取硫酸腺嘌呤(纯度为 98％)、盐酸鸟嘌呤(生化试剂)以及尿嘧啶各 0.1g于 250mL烧杯中,加75mL水和2mL浓盐酸,然后加热使其完全溶解,冷却,若有沉淀产生,加盐酸数滴,再加热,如此反复,直至冷却后无沉淀产生为止,以水稀释至 100mL。加少许甲苯于冰箱中保存。3.13D-泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇溶液:称取 D-泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇各 10mg于烧杯中,以水溶解并稀释至1000mL,将此液置于棕色试剂瓶中,加少许甲苯于冰箱中保存。3.14核黄素、盐酸硫胺素、生物素溶液:溶解 1mg生物素结晶于100mL0.02mol/L乙酸中,取此液 4mL(相当于 40μg生物素)于 2000mL烧杯中,加入 20mg核黄素和10mg盐酸硫胺素,以0.02mol/L乙酸溶解并稀释至1000mL。加少许甲苯于冰箱中保存,此试剂需保存于棕色瓶中,以防止核黄素被光破坏。3.15甲盐溶液:称取 25g磷酸氢二钾(K2HPO4)和 25g磷酸二氢钾(KH2PO4),加水溶解后稀释至 500ml,加少许甲苯以保存之。3.16乙盐溶液:称取10g硫酸镁(MgSO4·7H2O)、0.5g氯化钠、0.5g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)和 0.5g硫酸锰(MnSO4·H2O),加水溶解后稀释至500mL,加 5滴盐酸,加少许甲苯以保存之。3.17烟酸标准储备液(0.1mg/mL):准确称取 50mg已干燥恒重并贮于五氧化二磷干燥器中的烟酸标准品,以 25％乙醇溶液溶解并定容至 500mL,混匀,于冰箱中保存。此溶液每毫升相当于 100μg烟酸。3.18烟酸标准中间液(1μg/mL):吸取 1.00mL烟酸标准储备液,置于 100mL容量瓶中,用25％乙醇溶液定容,混匀,于冰箱中保存。此溶液每毫升相当于1μg烟酸。3.19烟酸标准使用液(0.1μg/mL):临用时吸取 5.00mL烟酸标准中间液,置于 50mL容量瓶中,用水定容,混匀。此溶液每毫升相当于 0.1μg烟酸。3.20基本培养基储备液:将下列试剂混合于 500mL烧杯中,加水至 450mL,用 40％氢氧化钠溶液调节 pH至6.8,以溴麝香草酚蓝作外指示剂,用水稀释至 500mL。酸解酪蛋白50mL50mL10mL10mL10mL10mL10mL10g胱氨酸、色氨酸溶液腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液D-泛酸钙、对氨基苯甲酸、吡哆醇溶液核黄素、盐酸硫胺素、生物素溶液甲盐溶液乙盐溶液无水葡萄糖无水乙酸钠10g(或结晶乙酸钠 NaAc·3H2O)(16.6g)3.21琼脂培养基:将下列试剂混合于 250mL三角瓶中,加水至100mL,于水浴上煮至琼脂完全溶化,以溴麝香草酚蓝为外指示剂,用 1mol/L盐酸趁热调节