\DB36备案号：18620-2006江西省地方标准DB36/T 485—2005猪尿中沙丁胺醇的测定-酶联免疫吸附法2005-12-25发布2006-02-01实施江西省质量技术监督局 发布 DB36/T 485—2005前言本标准由江西省农业厅提出。本标准起草单位：江西省兽药饲料监察所。本标准主要起草人：徐国茂、周伟良、万文根、姜文娟、刘安南、陈文云、胡翊炜。I DB36/T 485—2005猪尿中沙丁胺醇的测定-酶联免疫吸附法1范围本标准规定了猪尿中沙丁胺醇酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于猪尿中沙丁胺醇残留快速筛选检测。2方法原理测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对沙丁胺醇的兔抗体。经过洗涤步骤后，加入沙丁胺醇酶标记物、标准或样品溶液。沙丁胺醇与沙丁胺醇酶标记物竞争抗体，没有连接的沙丁胺醇酶标记物在洗涤步骤中被 除去。将酶反应底物(过氧化尿素)和显色剂(四甲基联苯胺)加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的显色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处测量 ，吸收光强度与样品中的沙丁胺醇浓度成反比。3试剂与材料以下试剂除特别注明外均为分析纯，水为蒸馏水。3.1微孔板酶标仪(450nm)3.2离心机(2500rpm以上)3.3微量加样器(20μL、50μL、100μL、200μL、250μL)3.4酶标板3.5沙丁胺醇酶标记物3.6沙丁胺醇标准液(0、0.1 ng/L、0.3 ng/L、 0.9 ng/L、 2.7 ng/L、 8.1ng/L)3.7酶反应底物(含有过氧化尿素)3.8显色剂(四甲基苯胺)3.9磷酸缓冲液(PBS)3.10洗液(PBST)3.11反应停止液(1mol/L盐酸)4制样取10mL尿样以2500rpm离心10分钟后取上清部分(清亮部分)用于检测。若尿样呈浑浊状，需先用滤纸过滤，再取10mL尿样以2500rpm离心10分钟后取上清部分(清亮部分)用于检测。5测定5.1测定之前将所有试剂及供试样品回温到20℃～25℃。5.2测定程序(20℃～25℃)5.2.1将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。倒出孔中的抗体液，用PBST液洗涤三次。每次洗板应加入洗液后2分钟再倒掉。5.2.2加入50μL的标准液或处理好的样品液到各自的微孔中。5.2.3加入100μL稀释的酶标记物到微孔底部，25℃～30℃孵育30分钟上。1 DB36/T 485—20055.2.4倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打(每行拍打3次)完全除去孔中的液体，用250μL稀释后的PBST充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两次。每次洗板应加入洗液后等2分钟再倒掉。5.2.5反应底物与显色剂以1︰1混合后加入100μL到微孔中，充分混合并在20℃～25℃暗处孵育15分钟。5.2.6加入50μL反应停止液到微孔中，混合好在450nm处测量吸光度值，应在加入停止液后10分钟内读取读取吸光度值。5.3结果判定和表述按下式计算百分吸光度值：百分吸光度值=B/BOⅹ100%式中：B-为标准溶液或供试样品的平均吸光度；B0-零标准的标准溶液平均吸光度值；以X轴为标准溶液中沙丁胺醇浓度(ng/L)的自然对数，Y轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。从标准曲线上查出供试样品中沙丁胺醇的浓度(ng/L)。也可以用专业计算机软件求出供试样品中沙丁胺醇的浓度。检测结果小于1000ng/L时判为未检出；大于或等于1000ng/L时为可疑阳性，需要用确证法复检，复检后小于或等于1000ng/L为未检出，大于1000ng/L为阳性。6检测方法灵敏度、准确度、精密度6.1灵敏度本方法在猪尿中的检测限为1000ng/L。6.2准确度本方法在1000ng/L添加浓度回收率为60％～120％。6.3精密度本方法的批内变异系数CV≦30%,批间变异系数为CV≦45％。7其他7.1试剂盒应放在2℃～8℃冰箱内保存。7.2操作时要戴上医用乳胶手套。______________________2