ICS65. 020. 01 DB21B05 辽 宁省地方标准DB21/ T2341—2014马铃薯种薯（种苗）病毒多重 RT- PCR检测技术规程2014 -07 -05发布2014 -09 -05实施辽宁省质量技术监督局发布 DB21/ T2341—2014 前言本标准按照GB/ T1. 1—2009给出的规则起草。本标准由沈阳市农业科学院提出。本标准由沈阳市质量技术监督局归口。本标准起草单位：沈阳市农业科学院、辽宁省农业科学院、铁岭市农产品质量安全检验检测中心。本标准主要起草人：杨双、潘菊、左丽君、岳玲、王辉、李金凤、马东梅、刘延斌、孙嘉兴、李雪。1 DB21/ T2341—2014 马铃薯种薯（种苗）病毒多重 RT- PCR检测技术规程1 范围本标准规定了马铃薯种薯（种苗）的总RNA提取、多重RT- PCR扩增、电泳检测及结果判定的方法和操作规程。本标准适用于马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB18133- 2012 马铃薯种薯GB/ T29377- 2012 马铃薯脱毒种薯级别与检验规程3 术语和定义下列术语及定义适用于本标准。3. 1 马铃薯 Y病毒（pot at ovi r usY，PVY）马铃薯Y病毒( Pot at ovi r us Y,简称PVY)，在马铃薯上引起严重花叶或坏死斑和坏死条斑。PVY是马铃薯Y病毒属（Pot yvi rus）的主要成员，病毒粒体线形，长730nm，该病毒寄主范围较广，可侵染茄科多种植物。病毒基因组为9. 7Kb的单链正义RNA，基因组5′端共价结合基因组连接蛋白（VPg），3′端含有Pl oyA尾巴，该基因组为一个长的开放读码框（ORF），可翻译成一个多聚蛋白，随后切割产生8~10个产物。3. 2 马铃薯 A病毒（pot at ovi r usA，PVA）马铃薯A病毒( Pot at o vi rus A,简称PVA)，在马铃薯上引起轻花叶或不显症。PVA是马铃薯Y病毒属（Pot yvi rus）成员，病毒粒体线形，长730nm，其寄主范围较窄，仅侵染茄科少数植物。病毒基因组为近1Kb的单链正义RNA，基因组5′端共价结合基因组连接蛋白（VPg），3′端含有Pl oyA尾巴，该基因组包含一个开放读码框（ORF），可翻译成一个多聚蛋白，随后切割产生11个产物。3. 3 DEPC水（DEPC- Tr eat edWat er）2 DB21/ T2341—2014 DEPC是焦碳酸二乙酯,分子式为CH10O5，分子量为162.14，通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环6结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性，常用于生物实验中RNA的提取等。DEPC水指经过是指用DEPC处理过并经高温高压消毒的纯水。3. 4 反转录-聚合酶链式反应RT- PCR（Rever seTr anscr i pt i on- Pol ymer as eChai nReact i on）一种在体外利用反转录酶将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应，实现扩增RNA上特异片段的技术。3. 5 cDNA互补DNA，指与单链RNA互补的DNA，此为单链cDNA分子，或以此单链DNA为模板合成另一条与其互补的单链DNA,两条互补的单链DNA分子组成一个双链cDNA分子。4 原理本标准涉及的马铃薯Y病毒（PVY）和马铃薯A病毒（PVA）属于单链正义RNA病毒，在宿主内以RNA形式存在，通过提取待测植物组织总RNA,利用2对引物的多重RT- PCR方法扩增2种病毒的特异序列，通过琼脂糖电泳检测目标条带的有无，确定是否感染相应病毒。5 仪器设备及试剂5. 1 仪器设备PCR仪；水平电泳槽；电泳仪；万分之一电子天平；微量加样器；恒温水浴锅；磁力搅拌器；高速冷冻离心机；紫外-可见成像系统；高压灭菌锅；pH计等。5. 2 试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA- Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tr i s）；硼酸；盐酸（HCl，36%）；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；氯化钠（NaCl）；氯化锂溶液（LiCl，10 mol / L，RNase- f r ee）；氢氧化钠（NaOH）；?-巯基乙醇；无水乙醇；M-MLVRever se Tr ans cr i pt as e（200uni t s/μL）；Ol i go（dT）15（10 μmol/ L）；（dN）9（10 μmol/μL）；dNTPs（10 mmol / L）；RNasei nhi bi t or（40uni t s/μL）；二硫苏糖醇（100mM）；2×TaqPCRMi x( wi t hDye)；引物；DEPC水；琼脂糖；Gol dVi ew染料等。5. 3 溶液配制相关溶液配制方法见附录A。6 方法步骤6. 1 抽样按照GB/ T29377- 2012的规定进行抽样。3 DB21/ T2341—2014 6. 2 总RNA提取6. 2. 1 组织裂解将少量样品（植物叶片、块茎芽眼或者脱毒种苗茎叶）在液氮中迅速研碎，取约0. 05 g加入盛有500 μLCTAB提取RNA缓冲液的2mL离心管中，振荡混匀后于65℃水浴10mi n。6. 2. 2 去蛋白质加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）抽提，4℃ 10, 000r pm离心5mi n后，将上清液转移至1. 5mL离心管。6. 2. 3 沉淀 RNA加入总体积1/ 4的10mol / LLi Cl，- 20℃放置2h后，4℃10, 000rpm离心10mi n，弃上清。6. 2. 4 去多糖、盐等杂质用DEPC水溶解沉淀，加入总体积1/ 10的3mol / LNaAC（pH 5. 2）混匀，再加入2倍体积无水乙醇，-20℃放置20 min，4℃ 10, 000 rpm离心10 mi n，弃上清。70%乙醇洗涤沉淀2次，放置超净工作台上吹干，加入50μLDEPC水溶解。6. 3 多重