ICS 65.020.01 B 04 DB12 天津市 地方标准 DB12/T 505—2014 玉米转基因成分筛查方法 Screening method for genetically modified maize 2014-04-22发布 2014-07-20实施 天津市质量技术监督局发布  DB12/T 505—2014 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由天津市质量技术监督局提出。 本标准起草单位：天津市东丽区产品质量监督检验所、天津市农业质量标准与检测技术研究所。 本标准主要起草人：黄凤军、李建、赵新、陈杰、易萌、朱珠、马强、杨炳存。 本标准 2014年04月首次发布。 I  DB12/T 505—2014 玉米转基因成分筛查方法 1范围 本标准规定了玉米中转基因成分定性 PCR筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。 本标准适用玉米及其制品中zSSIIb 内标准基因、CaMV35S 启动子、NOS 终止子、Bt 基因、bar 基因、HPT基因的定性PCR筛查检测 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 672转基因植物及其产品检测通用要求 农业部 2031号公告—19—2013转基因植物及其产品检测抽样 农业部 1485号公告—4—2010转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 zSSIIb基因 zSSIIb gene 编码玉米淀粉合酶异构体 zSTSⅡ-2的基因。 3.2 3.3 3.4 CaMV 35S启动子 35S promoter from cauliflower mosaic virus（CaMV） 来自花椰菜花叶病毒的 35S启动子。 NOS终止子 terminator of nopaline synthase（NOS）gene 来自胭脂碱合成酶基因 NOS的终止子。 Bt基因 Bt（Bacillus thuringiensis）gene 来源与苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis，简称Bt），可表达一种杀虫晶体蛋白的基因，常 见的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/cry1Ac融合基因。 3.5 bar基因 bialaphos resistance gene 来源于土壤吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus），编码膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinthricin acetyltransferase，PAT）。该酶具有对除草剂草丁膦（glufosinate）的耐受性。 3.6 HPT基因 HPTgene 来源于大肠杆菌或链球菌（Streptomyceshygroscopicus），编码潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase）的基因。 1  DB12/T 505—2014 4检测方法 4.1试剂和材料 4.1.1实验用水为重蒸馏水或符合 GB/T 6682规定的一级水。 4.1.2琼脂糖。 4.1.310g/L溴化乙锭溶液：称取1.0 g溴化乙锭（EB），溶于100 mL水中，避光保存。 注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。 4.1.410mol/L氢氧化钠溶液：在160 mL水中加入80.0 g氢氧化钠（NaOH），溶解后再加水定容 到 200 mL。 4.1.5500 mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）：称取 18.6 g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2）， 加入 70 mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液（4.1.4），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠 溶液（4.1.4）调 pH至8.0，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌 20 min。 4.1.61 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）：称取121.1 g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶 解于 800 mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌20 min。 4.1.7 TE缓冲液（pH 8.0）：分别量取10 mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（4.1.6）和2 mL乙二 铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌 20 min。 4.1.850×TAE缓冲液：称取242.2 g三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用300 mL水加热搅拌溶解后， 加 100 mL乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到 1 000 mL。使用 时用水稀释成 1×TAE。 4.1.9加样缓冲液：称取 250.0 mg溴酚蓝，加10 mL水，在室温下溶解12 h；称取 250.0 mg二甲基 苯腈蓝，用 10 mL水溶解；称取50.0 g蔗糖，用30 mL水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至 100 mL，在 4℃下保存。 4.1.10 4.1.11 DNA分子量标准：可以清楚的区分50 bp～1 000 bp的DNA片段。 dNTPs混合溶液：将浓度为10 mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸 溶液等体积混合。 4.1.12 4.1.13 Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液及25mmol/L氯化镁溶液。 引物：玉米内标准基因和转基因玉米外源基因检测时所用的引物序列见表 1。 表1玉米内标准基因和转基因玉米外源基因引物序列 检测基因 引物序列 扩增片段长度 基因性质 zSSIIb -F：5′- CTCCCAATCCTTTGACATCTGC -3′ zSSIIb -R：5′- TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG -3′ 35S -F：5′-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3′ 35S -R：5′-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3′ NOS -F