ICS65.020.20 B 21 DB11 备案号： 北 京 市 地 方 标 准 DB11/T 829—2011 白菜品种纯度及真实性分子检测方法 Methods of identifying varietal purity and genuineness of Chinese cabbage by using molecular markers 2011-11-10发布 2012-03-01实施 北京市质量技术监督局 发布  DB11/T 829—2011 目 次 前言................................................................................. II 1范围............................................................................... 1 2规范性引用文件..................................................................... 1 3术语与定义......................................................................... 1 4原理............................................................................... 2 5仪器设备及耗材..................................................................... 2 6试剂和溶液配制..................................................................... 2 7引物选用原则及筛选方法............................................................. 3 8操作步骤........................................................................... 4 9检测结果........................................................................... 6 附录A（规范性附录）所用溶液的配置方法 .............................................. 8 附录B（欧亿·体育（中国）有限公司性附录）白菜品种纯度检测常用的SSR引物名称及序列....................... 11 附录C（欧亿·体育（中国）有限公司性附录）白菜真实性鉴定常用的ISSR引物名称及序列........................ 13 附录D（规范性附录）白菜基因组DNA提取方法......................................... 15 附录E（规范性附录）6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法 ................................... 17 附录F（规范性附录）5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法 ................................. 19 I  DB11/T 829—2011 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由北京市农业局提出。 本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。 本标准由北京市农业局组织实施。 本标准起草单位：北京市种子管理站。 标准主要起草人：田雷、赵山普、贾希海、赵青春、彭瑞迪、王辉、福德平、高勇、张连平、黄寰。 II  DB11/T 829—2011 白菜品种纯度及真实性分子检测方法 1范围 本标准规定了结球白菜和不结球白菜种子品种纯度及真实性鉴定的SSR、ISSR分子标记检测方法和 对检测结果的判定标准。 本标准适用于结球白菜和不结球白菜常规种子、杂交种子及其亲本的品种纯度和真实性鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.4农作物种子检验规程发芽试验 GB/T 3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定 3术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 SSR标记 simple sequence repeat marker，SSR 简单重复序列（SSR）,又称短串联重复序列或微卫星序列，它是一类以1bp～5bp的短核苷酸序列为 基本单位串联重复状分布于整个基因组内的重复序列。 3.2 ISSR标记 inter simple sequence repeat marker，ISSR 内部简单重复序列(ISSR)，是利用包含重复序列并在3’端或5’端锚定的单寡聚核苷酸引物对基因 组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。 3.3 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction，PCR 一种用于在体外扩增DNA序列的技术程序。模板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶的作 用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发 生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，使引物得以延 伸。然后不断重复变性、退火和延伸这一循环过程，使欲扩增的基因片段呈几何倍数扩增。 3.4 引物primer 1  DB11/T 829—2011 在DNA合成反应时，提供3’－OH末端作为DNA合成的起点,能够与DNA模板特定区域特异结合的多核苷 酸单链。 4原理 简单重复序列（SSR）和内部简单重复序列(ISSR)广泛分布于白菜基因组的不同位置上。每个位点 的重复单位或序列会因为品种的不同而存在遗传结构上的差异，这些差异表现为多态性。针对重复单位 或序列的不同，设计相应的SSR引物和ISSR引物，通过PCR技术进行扩增、电泳、染色，形成白菜品种的 SSR和ISSR指纹图谱，进行白菜品种纯度和真实性的鉴定。 5仪器设备及耗材 5.1仪器设备 5.1.1天平(感量0.0001g、0.001g、0.01g、0.1g）。 5.1.2水浴锅(0℃～100℃）。 5.1.3