ICS 65.020.20 ICS 65.020.20 DB22 吉 林省地 方标准 DB 22/T 2988—2019 白灵菇和杏鲍菇菌种真实性鉴定 ITS-RFLP 法 Verification of genuineness for Pleurotus tuoliensis and Pleurotus eryngii strain—ITS-RFLP 2019-05-27发布 2019-06-17实施 吉林省市场监督管理厅 发布 本标准仅供内部使用 本标准仅供内部使用 印 本标准仅供内部使用 不得翻 印 前 言 前 言 江波。 DB22/T 2988—2019 本标准仅供内部使用 本标准仅供内部使用 印 本标准仅供内部使用 不得翻 印 DB22/T 2988—2019 白灵菇和杏鲍菇菌种真实性鉴定 ITS-RFLP法 范围 本标准规定了白灵菇和杏鲍菇菌种真实性鉴定ITS-RFLP法的原理、试验条件、试剂、设备仪器、样 品、试验步骤、试验数据处理、试验报告。 本标准适用于白灵菇和杏鲍菇菌种（母种、原种和栽培种）真实性检测和鉴定。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8979-2008 纯氮、高纯氮和超纯氮 NY/T 1730-2009 食用菌菌种真实性鉴定 ISSR法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 ITS-RFLP internal transcribed spacer – restriction fragment length polymorphism 内转录间隔区-限制性片段长度多态性。 白灵菇 Pleurotus eryngii var.tuoliensis C.J.Mou 侧耳属，刺芹侧耳变种或亚种，子实体通体白色。（GB/T - 12728） 杏鲍菇 Pleurotus eryngii 又名刺芹侧耳，菌柄白色，菌盖灰褐色。 3.4 PCR扩增 polymerase chain reaction 聚合酶链式反应。 4 原理 利用真菌内转录区域保守的引物 ITS1 和 ITS4，扩增真菌内转录区域，然后对 PCR 产物进行酶切， 根据酶切片段大小对白灵菇和杏鲍菇菌种真实性进行鉴定。 5 试验条件 1 DB22/T 2988—2019 DB22/T 2988—2019 试剂与材料 除非另有说明，在分析中仅适用分析纯试剂和去离子水或相当纯度的水。 超纯水（ddH2O）：符合GB/T 6682 规定的二级水，密封、4 ℃ 保存。 10 mol/L 氢氧化钠溶液：在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠（NaOH），溶解后，冷却至室温， 再加水定容至 200 mL。 500 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（pH 8.0）：称取 18.6 g 乙二胺四乙酸二钠， 加入 70 mL 水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液（见 6.4） 调 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa (121 ℃)条件下灭菌 20 min。 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCL）溶液（pH 8.0）：称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲 烷溶解于 800 mL 水中，用盐酸调 pH 至 8.0，加水定容至 1000 mL。在 103.4 kPa (121 ℃)条件下 直至 EDTA-Na2 完全溶解，用氢氧化钠溶液（见 6.4） 灭菌 20 min。 6.5 1.5 mol/L 氯化钠（NaCL）溶液：在 160 mL 水中加入 17.6 g氯化钠，溶解后，冷却至室温， 再加水定容至 200 mL。 6.6 三氯甲烷（CHCL3）：避光、密封、4 ℃ 保存。； 6.7 异戊醇（C5H12O）：避光、密封、4 ℃ 保存。 乙醇(C2H6O)：密封、室温保存。 dNTPs混合溶液：将浓度为 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等