纳微米技术应用于药物传递具有多种形式如脂质体、纳微米囊泡、粒子等,这 些剂型可W改变药物的吸收、分布与代谢等药代动力学参数,在生物展学领域具有 很好的应用前景。本课题研究了几种纳微米制剂的制备工艺及其在骨科治疗、免疫 疫苗领域的应用可行性。 本研究主要分为W下H部分: 1.淫羊藉巧纳米粒:通过超声透析方法制备了载淫羊蕾巧PLGA纳米粒。实 验结果表明制备淫羊蕾昔纳米粒粒径均一性良好,具有良好的生物相容性及缓释性 能;淫羊蕾昔纳米粒对成骨细胞的生长无明显影响,但能明显促进成骨细胞分化。 2.骨铅向纳米囊:通过改性明胶与丹宁酸的交联作用稱合硬膜板法,制备了 纳米囊。ZIF-8为硬模板调控囊壁和囊腔的结构,纳米囊表面连接铅向分子。通过 此法制备的纳米囊粒径均一,既具有缓控释性能亦具有很好的骨亲和能力。 3.OVA蛋白微囊:通过丹宁酸与铅离子配位作用锅合硬模板法制备微囊。碳 酸巧为硬模板调控囊壁和囊腔的结构。通过此方法制备的微囊具有pH响应性,包 载OVA蛋白的微囊通过体外实验具有良好的生物相容性,细胞毒性较小。 关键词:纳米粒,纳米囊,微囊,缓释 1 北京帖和区学院硕丄-毕业论义 ABSTRACT Microspheresandnanotechnologyfordrugdeliveryhavedifferentformsof nanotechnologysuchasmicroparticles,liposomes,nanoparticles.These打ewdm呂forms canchangethepharmacoki打eticparameters,andmaycrossbiologicbarriers,andhas prospectfiiUireinmanyfields.Thispapermainlys1:udiedtheapplicationof na打otechnologyintreati打gbo打ediseasesandvacci打efield.了herearethreepartsof experiments. 1.Icariin-loadedPLGAnanoparticles:Prepari打gicariin-loadedPLGAnanoparticles byultrasiflcationemulsificationandstudyingtheirphysicalandchemicalproperties, realeaseoficariin,andtheeffectonhuma打osboblastcellsinvitro.ThePLGA nanoparticleshaduniformparticlesizeandshowed化ebestpropertyofsustanedrealease andbiocompat化ility.Meanwhile,theicariinnanopaticleshadnoeffectondiegrowthof MG-63cells,butpromotedthedifferentiationofos化oblastcells. 2.Nanocapsulesforbo打etargeting:Adualhard-templateapproachcouplingwith coordinationi打teractionbetweenTAandmodifiedgelatinwasexploi1:edtoprepare na打ocapsules.之IF-8wasutilizedtomediatetheformationofnanocapsulesshelland lumen.Thesurfacenanocapsuleswereconnectedtotargetmolecules.Thenanocapsules haduniformparticlesizeandshowedthebestpropertyofsustanedrealease.Meanwhile, 也eyshowedgoodboneaffinity. 3.OVA-loadedmicrocapsules:Adualhard-templateapproachcouplingwith coordinatio打interactionbetweenTAandA13+wasexploitedtopreparemiacrocapsules. CaC〇3wereutilizedtomediate化eformatio打ofnanocapsulesshellandlumen. Microcapsulespreparedbythisme化odwerepHresponsive.Byvitroexperiments, OVA-loadedmiacrocapsulesshowed1:hegoodbiocompat化ility. Keywords;打anoparticles,nanocapsules,miacrocapsules,controlledrelease 2 北京化和巧学院硕Jr 第一章纳微米制剂在骨疾病治巧及疫苗方面的应用 1前言 纳米、微米尺寸大小的颗粒物质,可作为载体包载或吸附活性药物成分。利用 微纳米载体包载药物具有W下的特性;如增加药物的分散性、提高生物利用度;增 强缓释作用;提高给药靴向性等。目前常见的微纳米载体有脂质体、纳米粒和微球 等。基于本文实验研究的内容,本报告主要重点阐述微纳米递送系统在骨疾病治疗 及疫苗方面的应用。 2微纳米递送系统在骨科治疗方面的应用 骨組织存在火量的巧,使其具有一些特殊的生物学性质如血流量低、密度大、 渗透性差等,这给临床给药带米一定难度,一般给药途径很难使药物到达病灶部位, 而全身给药虽能达到药效,却对非骨组织造成严重的不良反应;另一方面治疗骨疾 病的药物多W亲脂性药物为主,如何提高他们的溶解度和生物利用度也是一大难题 1|,21近几年微纳米技术被越来越多地用于骨组织再生与修复,提高骨的植入愈合, 预防感染W。由于微/纳米颗粒具有尺寸小,表面积大,表面可修饰等特点,有望为 骨再生与修复创造新的复合材料和交付系统,克服传统治疗方法的局限。本文主要 从微/纳米颗粒载药体系,表面祀向修饰及微/纳米颗粒与支架材料的复合兰个方面 论述微纳米技术在骨组织再生与修复方面的应用。 2.1微/纳米粒介导的药物传递 治疗骨疾病的药物主要分为传统药物,细胞生长因子,基因药物H大类。运用 微/纳米载体包载药物,从而改变药物的物理化学性质(亲疏水性,溶解度,释放特 性等),从而影响药物的生物药剂和药代动力学性质,达到増强药物疗效、降低药 物副作用、提高治疗指数的目的W。 2丄1生长因子 骨再生过程中存在多种骨生长因子的表达W,Tatsuyana认为在骨缺损处的多种 骨生长因子缺乏或活性不足是影响骨再生的重要原因,局部应用外源性生长因子可 3 北京协和區学院硕± 促进骨缺损修复W。已知的骨生长因子有包括BMP在内的转化生长因了家族TGFs、 血管内皮生长因子VEGF、成纤维细胞生长因子FGF等。这些生长因了间接或直接 地促进祀细胞的趋化、增殖、分化及细胞内基质形成或偶联骨形成和骨吸收W。然 而生长因了生物活性不稳定,半衰期短,易发生流失、降解和吸收,不能充分发挥 其骨诱导作用t8’9i,因此许多研究将其与微纳米载体材料相结合应用于骨创伤修复。 Oldham等将人重組BMP-2蛋白包载进PLGA,生长因了可通过PLGA的降解缓慢 释放出来W1。利用碳酸巧纳米粒包载PDGF研究其对骨再生的影响,研究发现它比 单独使用PDGF因子更能促进骨再生。另有人研究了利用壳聚糖,哲基憐灰石等作 为载体包载生长因子,取得了一定的效果tW。 2丄2传统药物 治疗骨的药物多是亲脂性药物,如淫羊蕾昔,他汀类(辛伐他汀、洛伐他汀) 等,然而水溶性都比较差,生物利用度差。淫羊蕾巧主要通过上调BMP2的表达, 激活BMP2-Smads-Rimx2和BMP2-P38MAPK信号通路,最终促进表达成骨特异蛋 白如碱性磯酸酶(ALP)、骨钩素(OCN)、骨诞蛋白巧S巧促进骨再生。研究发 现曰服含淫羊蕾昔的相关药物时,淫羊蕾巧在胃中较为稳定,但当它到达肠道时会 很快代谢,致使其曰服利用率低。采用新型纳米材料将淫羊蕾巧制备成磁性纳米脂 质体,不仅提高了它的利用度,还增强了祀向治疗效果他巧类药物在肝脏中通 过抑制3-経基-3-甲基戊二醜辅酶A还原酶闲MG-CoA)活性抑制胆固醇生成,从而 通过诱导成骨活动导致骨的生成U6’I然而研究发现他汀类药物在体内会产生一些 副作用如横纹肌溶解及较差的水溶解性tW。有研究者合成两亲性共聚物BPPD包载 辛伐他汀,结果显示辛伐他汀纳米粒可1^减少体内辛伐他汀的摄入总量及控制它的 释放,促进骨生成tW。 2.1.3基因药物 由于基因治疗是通过基因转染产生和分泌生长因子,比生长因子制备更简单, 使用更方便。基因转染方法包括物理、病毒、化学方法,病毒载体具有高的转染效 率的同时可能带来一些危害如激活人体免疫、激活癌基因表达、一种病毒基因与另 一种病毒基因的重组及有限的基因装载能力PW。通过微/纳米颗粒携带基因转染可 减少这些问题及提高转染效率。微/纳米颗粒具有亚细胞的尺寸,能有效地被细胞内 吞,通过细胞内吞作用,实现核酸向细胞内的转运,进入细胞的微/纳米颗粒可W快 速从溶酶体中逃出来,使基因免受多种酶的消化降解pil另外,微/纳米粒还可通过 转运通道穿过血脑屏障及骨血屏障。微/纳米介导的骨基因转染主要可W分为DNA 体外转染植入体内P21,体内转染P33,及siRNA传递。DNA主要是一些骨生长相关 因子的基因序列。不同于DNA,siRNA主要用于致使鞭基因沉默,主要研究其在 4 北京协和区学院硕-上 骨肿瘤及抑制破骨细胞形成中作用P4’25l。胶原蛋白、超基憐灰石、PLGA等都可作 为基因的载体材料。 2.2骨祀向微/纳米粒 骨组织的主要成分为哲基憐灰石,哲基磯灰石形式存在于骨基质中的巧占人 体总巧量的99%。与径基磯灰石有特异亲和力,能与骨巧结合的分子可作为骨祀向 的导向物和载体,从而使药物选择性地作用于骨细胞PW,减少其他组织的副作用。 将纳米粒与鞭向分子相结合,能使药物顺利抵达骨病变部位,从而提高治疗效果, 降低不良反应。对骨有亲和力的分子主要可W分为四环素类药物、双麟酸类化合物 及其他一些化合物。这些分子本身可作为载体材料或吸附、化学连接在微/纳米颗粒 表面,从而达到靴向作用。 2.2.1四环素类化合物 四环素有较强的形成金属配位的能力,能与哲基磯灰石中的Ca2+络合能 沉积于骨組织,对骨有很好的亲和力。四环素可通过化学合成与一些药物连接,如 与转移生长因子TGF通过聚乙二醇偶联,与P-雌二醇通过了二醜偶联等,但是 并不是所有研究都表明合成的新化合物一定能在体内水解释放出药物发挥药效。 Wang等将聚丙交酷乙交醋(PLGA)与四环素CTQ相连,然后通过溶剂乳化法制备 的TC-PLGA纳米粒可W用来包载骨治疗相关药物如辛伐他汀,用于治疗骨质疏松, 结果也表明形成的纳米颗粒具有很好的骨细胞相容性,对骨亲和力较大,包载的药 物能缓慢地释放,在高骨密度处聚集。 2.2.2双勝酸类化合物 側OH HO、占fi/OH 〇 ' /;x々〇RiR2 图1双麟酸化学结构式 双隣酸类是另一类对骨有亲和力作用的化合物,它本身具有一定的抗肿瘤作 用。如上图所示,其分子结构中R2为可变的脂肪侧链,其改变可影响双麟酸的活 性(主要为抑制破骨细胞的形成),民1一般为哲基,可与二价阳离子如Ca2+、Mg2+、 Fe2+等形成配位化合物,骨的主要成分为巧决定了它能与骨相结合,P-C-P键是产 生骨靴向活性的必要条件PD’W。Sung等合成PLGA-Aln(Ain为阿仑隣酸钢)和 PLGA-PEG分子,后通过透析法制备了表面修饰的PLGA嵌段共聚物纳米粒,表面 5 北京化和巧学院硕.It 修饰分别为阿屈隣酸盐和聚乙二醇(PEG),研究表明PEG作为纳米粒的亲水性表 面,可W避开民隨细胞的吞隨,而纳米粒的骨吸附能力与阿屈麟酸盐的含量正相关, mPEG链越长,骨吸附能力越似321。Cong则采用PLGA-PEG分了制备纳米粒,通 过酷胺化反应将阿仑隣酸轴连接到纳米球上,形